Работа 1. Гидролиз дезоксирибонуклеопротеинов (ДНП)

Дрожжей и обнаружение компонентов ДНП в гидролизате.

 

Дрожжевые клетки богаты нуклеопротеинами. Проводят кислотный гидролиз дрожжей и с помощью ниженазванных реакций определяют продукты гидролиза.

Техника выполнения

В широкую пробирку с воздушным холодильником поместить 1 лопаточку сухих дрожжей и добавить 10 мл 10% раствора H₂SO₄. Поместить пробирку в кипящую водяную баню на 1 час. После гидролиза пробирку охладить и проделать с гидролизатом дрожжей качественные реакции на составные части ДНП.

Качественные реакции на составные части ДНП

Биуретовая реакция на полипептиды (белок). К 5 каплям гидролизата добавляют 10-12 капель 10% раствора едкого натра и 2 капли 1 % раствора сульфата меди, появляется розовая или розово-фиолетовая окраска.

Серебряная проба на пуриновые основания (демонстративный опыт). К 10 каплям гидролизата добавляют 10 капель раствора аммиака до щелочной реакции, затем 20 капель 2 % аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 мин. образуется светло-коричневый осадок серебряных солей пуриновых оснований.

Качественная реакция на пентозу (реакция Троммера). К 10 каплям используемой жидкости прибавляют 10 капель 10% раствора едкого натра и 5 капель 7% раствора сульфата меди. Осторожно нагреть верхнюю часть содержимого пробирки до закипания и кипятить ровно 1 мин. Появится красное окрашивание.

Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 10 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят. При этом жидкость окрашивается в желто-лимонный цвет. Пробирку охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лнмонно-желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония.

В выводе написать схему гидролиза ДНП.

Работа 2. Определение содержания мочевой кислоты

В сыворотке крови фосфорновольфрамовым методом.

Принцип метода

Мочевая кислота восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив (реактив Фолина) с образованием комплекса голубого цвета. Интенсивность окраски раствора, фотометрируемого при красном светофильтре (590-700 нм), пропорциональна содержанию в анализируемой жидкости мочевой кислоты.

В норме содержание мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,2 – 0,5 ммоль/л (0,24 – 0,5 ммоль/л – у мужчин, 0,16 – 0,4 ммоль/л – у женщин). Повышение содержания мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) и моче наблюдается при многих патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеидов (лейкозах, лучевой болезни, сахарном диабете и др.), при нарушении ее выделения из организма (заболевания почек). Резко увеличивается концентрация мочевой кислоты при подагре, это сопровождается отложением ее солей в суставах и различных тканях организма.

Снижение концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови наблюдается после применения АКТГ, салицилатов, при анемии, миеломной болезни, ксантинурии.

Ход определения

В пробирку вносят 8,0 мл дистиллированной воды, 1,0 мл сыворотки крови, 0,5 мл 0,35М раствора H₂SO₄ и содержимое пробирки перемешивают, затем добавляют 0,5 мл 10% раствора Na₂WO₄ и после тщательного перемешивания через 5-10 мин смесь фильтруют посредством бумажного фильтра. 3,0 мл полученного фильтрата используют для анализа.

В две другие пробирки отмеривают 3,0 мл дистиллированной воды (холостая проба) и 3,0 мл стандартного раствора мочевой кислоты.

В каждую пробирку вливают 1,5 мл раствора Na₂CO₃, содержимое пробирки перемешивают и вносят в нее 1,0 мл реактива Фолина. Раствор взбалтывают. Через 30 мин измеряют его оптическую плотность в кювете с шириной слоя 10мм при длине 590 – 700 нм (красный светофильтр ФЭКа). Показатели экстинкции опытной и стандартной проб сопоставляют с оптической плотностью с холостой (контрольной) пробы.

Расчет ведут по формулам:

Мочевая кислота (мг/100мл) = (Е_оп × С_ст×10) /Е_ст = (Е_оп×5) /Е_ст

Мочевая кислота (моль/л) = ((Е_оп× С_ст×10) /Е_ст) ×0,059 = ((Е_оп × 5) Е_ст) × 0,059, где Е_оп – экстинкция опытной пробы; Е_ст – экстинкция стандартной пробы (за вычетом оптической плотности контрольной пробы); С_ст - концетрация стандартного раствора) ×5 мг/100 мл; 0,059 – коэффициент пересчета в единицы СИ; 10 – коэффициент пересчета на сыворотку крови.