Работа 1. Количественное определение мочевины

В моче по Рашковану.

Принцип метода

основан на том, что мочевина с гипохлоритом натрия и фенолом образуют продукт зеленого окрашивания.

Ход определения

В пробирку поместить 0,1 мл разведенной в 100 раз исследуемой мочи, добавить 7 мл этилового спирта-ректификата и прилить 2,0 дистиллированной воды. К полученной смеси прибавить 1 мл 0,035 н. раствора НС1, тщательно перемешать, добавить 1 мл 1,2% раствора NaОС1, вновь тщательно перемешать и сразу же добавить 1 мл 5 % раствора фенола. Содержимое пробирки хорошо перемешать и поместить на 25 мин в термостат при температуре 55-60° С.

Окрашенный в зеленый цвет раствор охладить и колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром в кюветах толщиной 5 мм против воды. Концентрацию мочевины рассчитать с помощью калибровочного графика с учетом разведения мочи и суточного диуреза (1500-2000мл).

 

Работа 2. Определение содержания мочевины в сыворотке

Крови ферментативным методом.

Принцип метода

Уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака и двуокиси углерода. Аммиак реагирует с производными фенола и щелочным раствором гипохлорита с образованием цветного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в анализируемой пробе.

Реактивы. Рабочий раствор - уреаза, нитропруссид натрия+буферно-субстратный раствор рН 6,5. Реактив 3 - раствор гипохлорита натрия и гидроокиси натрия.

Ход определения

	Опытная проба	Холостая проба
Сыворотка крови, мл	0,02	-
Рабочий раствор, мл	2,0	2,0
Перемешать и инкубировать 10 мин при 37^0 С
Реактив 3, мл	2,0	2,0

Перемешать, выдержать 15 мин при комнатной температуре. Инкубационную смесь следует предохранять от воздействия прямого света. После инкубации измеряют оптическую плотность опытной (А) пробы против холостой пробы в кюветах на 10 мм при длине волны 670 нм на ФЭКе.

Расчет концентрации мочевины в опытной пробе проводят по формуле: С = (А/0,21)·10 ммоль/л. В норме – 3,5-9,0 ммоль/л.

Эталоны ответов на тесты

 

1.1. – 4

1.2. – 1

2.1. – 1-Б, 2-Г, 3-В

2.2. – 1-В; 2-А,Б; 3-А; 4-Б

3.1. – 1,2,3

3.2. – 1,2,3

4.1. – А (+ + +)

4.2. – В (+ + -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Аспарагиновая кислота может вступать в реакцию переаминирования, однако отсутствие кетокислот исключает эту возможность. Следует вспомнить роль аспарагиновой кислоты в биосинтезе мочевины и проследить судьбу углеродсодержащего остатка: найти в схеме биосинтеза мочевины конечный продукт орнитинового цикла, углеродный скелет которого принадлежит аспарагиновой кислоте, – он и будет содержать метку.

Задача 2.

СО₂ утилизируется печеночной тканью главным образом для синтеза мочевины через карбамоилфосфат. Проследите судьбу этого атома углерода в орнитиновом цикле и назовите все продукты, в состав которых последовательно войдет метка (последний из них - мочевина).

 

 

Занятие 35. Специфические пути метаболизма

Отдельных аминокислот.

 

Цель занятия. Усвоить пути метаболизма отдельных аминокислот в тканях.

Содержание занятия:

– контроль выполнения заданий по самоподготовке;

– выполнение заданий тестового контроля;

– выполнение практической работы по определению фенилпировиноградной кислоты в моче;

– участие в выступлении и обсуждении реферативных сообщений;

– контроль усвоения темы путем устного собеседования с преподавателем.

– качественное определение в моче фенилпировиноградной кислоты.

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1. Биосинтез аминокислот, образующихся из щавелевоуксусной, пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот у E. coli.

2. Биосинтез ароматических аминокислот у микроорганизмов.

Методические указания к самоподготовке

 

Используя лекции и учебники, ответьте на следующие вопросы и выполните задания:

1. Представьте схему метаболизма ароматических аминокислот.

2. Назовите дефекты ферментов при фенилкетонурии, тирозинемии, алкаптонурии, альбинизме.

3. Напишите реакции образования фосфатидилэтаноламина, карнитина и анзерина с участием S-аденозилметионина.

4. Дополните схему обмена цистеина:

5. Напишите структуру глутатиона и опишите его биологическую роль.

6. Дополните схему обмена глицина:

7. Напишите схему образования одноуглеродистых соединений из глицина.

 

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Задание 1. Выберите один наиболее верный ответ.

1.1. Заболевание (синдром), при котором наблюдается моча черного цвета –....

1. фенилкетонурия

2. изогиперстенурия

3. гиперпролинемия

4. алкаптонурия

5. уробилинурия

1.2. В данной реакции образуется....

1 – глутатион 2 – гомоцистеин

3 – таурин 4 – пируват

Задание 2. Установить соответствие.

2.1.

Дефект фермента:	Синдром:
1. фенилаланингидроксилаза 2. тирозиназа 3. оксифенилпируватоксидаза 4. гомогентизинатоксидаза	А. Алкаптонурия Б. Тирозинемией В. Альбинизм Г. Фенилкетонурия

2.2.

Аминокислоты, используемые в синтезе продукта:	Продукт:
1. креатин 2. карнозин 3. карнитин	А. аргинин Б. глицин С. метионин Д. ß-аланин Е. гистидин

Задание 3. Выберите сочетание правильных ответов.

3.1. При развитии фенилкетонурии в крови и моче накапливаются....

1 – фенилпируват;

2 – фенилацетат

3 – фениллактат

4 – фенилацетилглутамин

5 – фенилаланин

3.2. Метиленовая группа в молекуле метилен-Н₄-фолата может превращаться в....

1 – метенильную (–СН=)

2 – формильную (–НС=О)

3 – метильную (–СН₃)

4 – оксиметильную (–СН₂ОН)

5 – формиминовую (-СН=NH)

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите наличие причинной связи между ними.

4.1. Причиной развития альбинизма является мутация гена фенилаланингидроксилазы, потому что при этом заболевании в меланоцитах кожи и ее придатков нарушено превращение диоксифенилаланина (ДОФА) в ДОФА-хинон и далее в меланин.

4.2. В превращениях серина и глицина главную роль играют ферменты, коферментами которых служат производные фолиевой кислоты, потому что они служат донорами одноуглеродных фрагментов при синтезе пуриновых оснований и тимидиловой кислоты.

Примеры ситуационных задач

Задача 1.

Нормальные клетки Е. coli синтезируют все аминокислоты, но некоторым ауксотрофным мутантам, не способным к синтезу определенных аминокислот, для оптимального роста необходимо вводить эти аминокислоты в питательную среду. Аминокислоты нужны не только для синтеза белков; некоторые из них требуются для биосинтеза других азотсодержащих клеточных компонентов. Допустим, у нас имеются три ауксотрофных мутанта, лишенных способности синтезировать одну из трех аминокислот-глицин, глутамин или аспартат. Синтез каких азотсодержащих продуктов (помимо белков) будет нарушен у каждого из этих мутантов?

Задача 2.

Аминокислота метионин используется как лекарственный препарат с липотропным эффектом (удаляет из печени избыток жира) при жировом гипотозе, токсических поражениях печени, хроническом алкоголизме. Введение метионина при атеросклерозе вызывает снижение содержания в крови холестерина и повышения фосфолипидов. Объясните терапевтические эффекты метионина.

Для ответа на этот вопрос:

1 - перечислите биологические функции метионина,

2 - напишите реакцию активации метионина

3 - напишите схему участия активного метионина в синтезе сложных липидов.

Самостоятельная работа студентов

Занесите в тетрадь протокол лабораторной работы, оставляя место для записи наблюдений и вывода.