Работа 1. Количественное определение активности липазы 


Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Работа 1. Количественное определение активности липазы



В панкреатическом соке.

 

Работа позволяет качественно обнаружить наличие липазы в панкреатическом соке и дать количественную оценку ее действия.

Принцип метода

Метод основан на нейтрализации щелочью жирных кислот, образующихся при гидролизе жира ферментом липазой. Активность липазы определяется так называемым "липазным числом", т.е. количеством мл 0,1 н раствора КОН, идущего на нейтрализацию свободных жирных кислот, образующихся в результате гидролиза жира молока под влиянием 1 мл ферментного раствора.

Ход работы

Отмерить в 2 пробирки по 4 мл молока, 5-8 капель фенолфталеина и добавить одинаковое количество 0,1н раствора КОН до появления красной окраски (щелочь нейтрализует всю кислотность молока). После этого в одну пробирку добавить 2 мл предварительно прокипяченного панкреатического сока, в другую - некипяченого. Обе пробирки сверху залить 0,5 мл толуола для защиты от поглощения СО2 и поместить в термостат при 38°С на 30 мин. По истечении указанного времени пробирки вынуть, охладитъ и отметить обесцвечивание в пробирке с активным ферментом (щелочь нейтрализуется образующимся в результате гидролиза органическими кислотами). Содержимое этой пробирки оттитровать 0,1н раствором КОН до одинаковой окраски со второй пробиркой.

Расчет. Для определения липазного числа надо количество мл 0,1н раствора КОН, пошедшего на титрование, разделить на 2, т.е. на число мл ферментного раствора, взятого в опыт.

Работа 2. Количественное определение триацилглицеринов

В сыворотке крови.

Принцип метода

Триацилглицерины (ТАГ) омыляются гидроксидом калия с образованием глицерина, при окислении которого образуется формальдегид. Реактив, содержащий ацетилацетон взаимодействует с формальдегидом с образованием окрашенного продукта, интенсивность окраски которого определяют фотометрически.

Ход определения

ТАГ определяют, внося реактивы в 3 пробирки с притёртой пробкой в следующей последовательности:

Компоненты   Раствор, мл  
Опытная проба Эталонная проба Контрольная проба
Сыворотка крови, мл 0,1 - -
Эталонный раствор триолеина, мл - 0,1 -
Дистиллированная вода, мл - - 0,1
Изопропанол, мл      
  Перемешивают и добавляют мерной ложечкой адсорбент, г
  0,4 0.4 0,4
  Встряхивают на смесителе в течение 15 мин
  Центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин
Надосадочная жидкость, мл      
Раствор КОН, мл 0,5 0,5 0,5
  Инкубируют в водяной бане при 60оС в течение 15 мин
  Охлаждают в холодной воде
Окислительный раствор, мл 0,5 0,5 0,5
  Оставляют на 10 мин при комнатной температуре
Реактив на формальдегид (ацетилацетон), мл 0,5 0,5 0,5
  Инкубируют в водяной бане при 60оС в течение 30 мин

 

После охлаждения измеряют оптическую плотность опытной (Ео) и эталонной (Еэ) проб против контрольной пробы на ФЭКе при длине волны 410 нм в кюветах на 10 мм.

Расчёт. Содержание ТАГ рассчитывают по формуле: Х (ммоль/л)=Еоэ×3,39.

В норме содержание ТАГ в сыворотке крови составляет 0,45-1,85 ммоль/л или 0,5-1,5 г/л.

Наибольшее значение имеет определение ТАГ для установления типа наследственной гиперлипидемии (ІІб тип). Повышение содержания ТАГ бывает при геморрагической лихорадке, нефротическом синдроме, алкоголизме, гипотиреозе и др.

 

Работа 3. Количественное определение суммарных липидов

В сыворотке крови.

Принцип метода

Продукты распада ненасыщенных липидов образуют с реактивом, состоящим из серной, ортофосфорной кислот и ванилина, соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови. Определение содержания липидов в сыворотке крови проводится для изучения состояния липидного обмена в организме. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови (нормолипемия) колеблется от 4,0-8,0 г/л. При физиологических условиях увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наблюдается через 1-4 часа после принятия богатой жирами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипемия). Гиперлипемия проявляется при многих патологических состояниях: у больных сахарным диабетом отмечается резко выраженная гиперлипемия (до 20,0 г/л), при заболеваниях почек (липоидном нефрозе), при поражении печени (циррозе печени и остром гепатите), при ожирении, при врожденной гиперлипемии, атеросклерозе и у лиц, злоупотреблении алкоголем.

Ход работы

В две пробирки (опытная и контрольная) наливают соответственно 0,1 мл сыворотки крови и 0,2 мл воды. В опытную пробирку вносят 2,9 мл, в контрольную 5,8 мл концентрированной серной кислоты (ОСТОРОЖНО!). Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 минут (при нагревании обращаться с пробирками осторожно). После нагревания обе пробирки вынимают и быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Затем отбирают из опытной – 0,2 мл, а из контрольной – 0,4 мл охлажденного раствора и переносят его в чистые пробирки, в которых предварительно налито в опытную пробирку 3 мл, а в контрольную пробирку – 6 мл фосфорнованилинового реактива (наслаивать осторожно). После тщательного перемешивания пробы оставляют на 45 мин. в темноте при комнатной температуре. После развития окраски оптическую плотность опытного раствора (А) против контроля измеряют на ФЭКе при длине волны в 530 нм светофильтр зеленый с кюветой 5мм.

Расчёт содержания общих липидов в сыворотке крови проводят по калибровочному графику по формуле:

Х(г/л)=А×10000×3 / 0,2×1000

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. –В

1.2.– Б

2.1. 1. Б,Д; 2. Е, 3 А,В

2.2.– 1. В; 2. Б;Г; 3.В.; 4. Б; 5. Г; 6. Д,А

3.1. – 1, 3

3.2.– 1, 2, 3

4.1. Д (- + -)

4.2. – А (+ + +)



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 1863; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.235.140.73 (0.005 с.)