Кислотный гидролиз полисахаридов

При нагревании раствора крахмала или гликогена с минеральными кислотами происходит гидролиз полисахаридов с образованием a-D-глюкозы, присутствие которой можно обнаружить с помощью цветной реакции.

В пробирки помещают по 200 мг порошка выделенных крахмала и гликогена и добавляют по 5 мл 2%-ного раствора серной кислоты. Пробирки закрывают ватными пробками и помещают в кипящую водяную баню на час. По окончании гидролиза пробирки охлаждают, осадки отделяют центрифугированием при 1000 мин^-1 в течение 15 мин и 2-3 раза промывают небольшими порциями горячей дистиллированной воды для полного выделения моно- и олигосахаридов. Супернатанты объединяют с промывными водами. Полученные растворы нейтрализуют сухим гидрокарбонатом натрия до рН 7,0 и фильтруют через бумажный фильтр.

Качественный и количественный анализ гидролизатов

Убеждаются в отсутствии полисахаридов в гидролизатах путем проведения реакции с раствором Люголя.

Присутствие a-D-глюкозы в гидролизатах определяют по реакции Молиша. Углеводы при взаимодействии с концентрированной серной кислотой дегидратируются с образованием фурфурола и 5-оксиметилфурфурола, которые конденсируются с a-нафтолом с образованием триарилметанового хромогена. Последний окисляется серной кислотой, и образуется хиноидное соединение красно-фиолетового цвета.

На дно пробирки аккуратно вносят 2 мл концентрированной серной кислоты, сверху которой осторожно наслаивают 1 мл гидролизата и добавляют 0,5 мл 0,2%-ного спиртового раствора a-нафтола. Появление на границе раздела фаз красно-фиолетового кольца свидетельствует о присутствии в гидролизате моносахаридов.

Количественное определение содержания a-D-глюкозы в гидролизатах проводят по методу Миллера. При взаимодействии моносахаридов с 3,5-динитросалициловой кислотой последняя восстанавливается в 3-амино-5-нитросалициловую кислоту, имеющую желто-оранжевую окраску.

В пробирки вносят 1,5 мл гидролизатов и добавляют 1,5 мл динитросалицилового реактива. Пробирки закрывают ватными пробками и помещают в кипящую водяную баню на 15 минут. Затем пробирки быстро охлаждают до температуры (20 ± 2)°С и для стабилизации окраски приливают по 0,5 мл 40%-ного раствора сегнетовой соли.

Измеряют экстинкцию растворов при 582 нм в кюветах (l = 0,5 см) на фотоэлектроколориметре против контрольной пробы (вместо гидролизата берут дистиллированную воду, остальные реактивы добавляют в том же объеме и смесь выдерживают такое же время). Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение экстинкции.

Концентрацию глюкозы в исследуемом растворе определяют по калибровочному графику зависимости экстинкции от концентрации, предварительно построенному для растворов глюкозы с известной концентрацией.

Для построения калибровочного графика непосредственно перед измерением готовят растворы глюкозы с концентрацией 200, 400, 600, 800 и 1000 мкг/мл. Затем с каждым из растворов проводят цветную реакцию по вышеуказанной методике и измеряют величину экстинкции окрашенных растворов при 582 нм против контрольной пробы. Строят калибровочный график зависимости Е ₅₈₂ от концентрации глюкозы в растворе.

Следует помнить, что при каждой смене реактивов необходимо заново строить калибровочный график.

Динитросалициловый реактив. Взвешивают 1 г 3,5-динитро-салициловой кислоты, 1 г NaOH, 0,05 г Na₂SO₄, 0,2 г фенола и растворяют в дистиллированной воде при непрерывном перемешивании, доводя объем раствора до 100 мл. Срок годности раствора при хранении в защищенном от света месте и при температуре (20 ± 2)°С составляет 1 месяц.

Вопросы для самоконтроля

1. Что собой представляют моно-, олиго- и полисахариды?

2. Какие моносахариды относятся к альдозам, а какие – к кетозам? Приведите примеры.

3. Назовите, какие стереоизомерные формы характерны для моносахаридов. Как определить принадлежность моносахаридов, содержащих два и более асимметрических атома углерода, к D- или L-ряду?

4. Что такое эпимеры? Приведите примеры.

5. Напишите реакции образования циклического полуацеталя и циклического полукеталя из D-глюкозы и D-фруктозы соответственно.

6. Чем обусловлено существование a- и b-изомеров моносахаридов? Какой углеродный атом циклических альдоз называется аномерным?

7. Приведите различные способы изображения циклических форм моносахаридов. Какая из этих конформаций термодинамически более устойчива и почему?

8. В чем состоит суть явления мутаротации?

9. Напишите структурные формулы производных моносахаридов. Укажите их биохимические функции.

10. Какие функциональные группы моносахаридов принимают участие в формировании гликозидной связи и как ее обозначают? Напишите уравнение реакции.

11. Чем отличаются восстанавливающие олигосахариды от невосстанавливающих? Приведите примеры.

12. Какова роль в клетках резервных и структурных полисахаридов? Приведите примеры.

13. В чем состоят особенности выделения и анализа полисахаридов?

14. Объясните принцип качественной реакции Молиша на a-D-глюкозу.

15. На чем основан метод количественного определения a-D-глюкозы по Миллеру?