Клонирование - способ получения больших количеств

Идентичных молекул нуклеиновых кислот или их фрагментов

Технология рекомбинантной ДНК состоит в следующем.

Ген или фрагмент ДНК вклеивают в ДНК E.coli. Бактериальные клетки быстро размножаются, образуя миллиарды копий. В ДНК каждой из них содержится копия вставленного гена или фрагмента ДНК.

Известны несколько основных классов векторов, позволяющих встраивать исследуемый нуклеотидный фрагмент в геном клетки хозяина. К ним относятся плазмиды, лямбда-бактериофаги, хромосомы дрожжей или бактерий. Выбор определяется размерами переносимого фрагмента. Плазмиды могут переносить фрагменты менее 10.000 пар оснований, бактериофаги – до 25.000. Для переноса более крупных фрагментов используют векторы - химеры (плазмида-лямбда вектор), называемые космидами.

Еще более крупные фрагменты, необходимые для работы с геномом человека, переносят с использованием хромосомы дрожжей.

Приводим схему такого процесса с использованием плазмиды.

1) Выделение геномной (хромосомной) ДНК из исследуемых клеток.

2) Создание плазмидной библиотеки фрагментов ДНК человека, образовавшихся после действия рестриктаз. Фрагменты присоединяются к векторам, и последние переносят их в геном бактерии. Образуется коллекция колоний бактерий, каждая из которых содержит разные плазмиды с различными встроенными кусочками ДНК.

3) Посев колоний на чашки с агаром для последующего роста (так называемые «чашки хозяина»).

4) Снятие реплик с колоний бактерий, выросших на твердой питательной среде. Для этого накладывают и прижимают фильтр из нитроцеллюлозы на каждую такую чашку; часть из каждой колонии останется на чашке, часть – в виде реплики (отпечатка) на фильтре.

5) Разрушают (лизируют) бактерии на фильтре в условиях, при которых плазмидная ДНК станет одноцепочечной и свяжется с фильтром. Наличие на фильтре зон с одноцепочечной ДНК соответствует местоположению бактериальных колоний на чашке хозяина.

6) Нитроцеллюлозный фильтр обрабатывают, как и электрофореграмму, с использованием в качестве зонда комплементарный искомому гену меченый полинуклеотид. После радиоавтографии реплики, обработанной зондом, на рентгеновской пленке будет видно темное пятно, которое соответствует месторасположению на фильтре ДНК искомого гена.

7) Забор бактерий из соответствующей колонии, выращивание их в питательном бульоне и экстракция плазмидной ДНК. Она содержит в своем составе фрагмент ДНК человека с искомым геном.

Возможно, также клонировать ген Х с использованием антитела к белку, продуцируемому этим геном. В таком случае создается библиотека экспрессии. При её создании фрагменты ДНК человека встраиваются в плазмиды, которые содержат в своем составе сильный промотор E.coli (с кодоном АТГ). Клетки, с включенными в них такими плазмидами, будут синтезировать большое количество белка (трансляция). Если на фильтре сделать отпечатки колоний клеток с последующим их лизисом, высвобожденные белки можно подвергнуть зондированию при помощи антител. Тем самым будет обнаружена колония, которая содержит плазмиду, вызывающую экспрессию белка. В ней-то и содержится ген Х.

Таким образом, приведенное описание технологии клонирования гена, хотя и не передает полностью необычайную её сложность, дает возможность понять, как, используя рекомбинантную ДНК, становится возможным производить необходимые для медицины и экономики вещества, а также получать достаточно материала для дальнейших исследований.

 

Эталоны ответов на тесты контроля исходого уровня знаний

 

1.1. – В

1.2. – Г

2.1. – 1-В; 2-А; 3-Б; 4-Д; 5-Г

2.2. – 1-Б, 2-А, 3-В, 4-Г, 5-Е, 6-Д

3.1. – 1,2,3

3.2. – все

4.1. – А (+ + +)

4.2. – С (+ - -)

 

Эталоны ответов к ситуационным задачам

Задача 1.

У эукариотов:

a) Gly-Gln-Ser-Leu-Leu-Ile;

6) Leu-Asp-Ala-Pro;

в) His-Asp-Ala-Cys-Cys-Туг;

г) Met-Asp- Glu

У прокариотов:

fMet-Asp-Glu

Задача 2.

Достройку 5-концов цепей ДНК обеспечивает фермент теломераза (нуклеотидилтрансфераза). Фермент содержит в активном центре фрагмент РНК, служащий матрицей при синтезе теломерных повторов хромосом быстро делящихся клеток. С помощью РНК фермент комплементарно присоединяется к 3-концу недостроенной дочерней цепи ДНК. Теломераза по принципу комплементарности последовательно удлиняет 3-конец цепи ДНК в направлении 5¢®3¢ на один гексануклеотид ГГГТТА. Затем фермент смещается по цепи ДНК на один теломер и начинает синтез нового фрагмента ГГГТТА. ДНК-полимераза В не может заменять теломеразу, потому что не может вести синтез цепи ДНК от 3¢- к 5¢-концу. В большинстве соматических клеток теломерная ДНК имеет длину, достаточную для времени жизни клетки и её потомства, а потому укорочение дочерних цепей не представляет опасности.