Работа 4. Количественное определение протеолитической

Активности желудочного сока по Ансену.

Принцип метода

О протеолитической активности желудочного сока судят по количеству образующихся при расщеплении казеина неосаждаемых трихлоруксусной кислотой пептидов, количество которых соответствует количеству определяемого в них ароматических кислот.

Ход определения

В две центрифужные пробирки отмерить по 1 мл желудочного сока, разведенного в 10 раз. В опытную пробирку добавить 1,0 мл 5 % раствора казеината натрия, а в контрольную - 2,0 мл 5 % ТХУ. Содержимое пробирок перемешать, поместить в термостат при температуре 38° С на 20 мин. После термостатирования в контрольную пробу добавить 1 мл 5 % раствора казеината натрия, в опытную - 2,0 мл 5 % ТХУ. Выдержать 15 мин. Далее центрифугировать 15 мин при 3000 об/мин. После этого отобрать в 2 биологические пробирки по 1 мл центрифугата (надосадочной жидкости) и по 5 мл 0,5 н раствора Nа₂СО₃. При перемешивании в обе пробирки добавить по 1 мл реактива Фолина и выдержать 20 мин. Оптическую плотность опытного раствора измерить на ФЭКе при длине волны 760 нм (красный светофильтр) в кювете толщиной 10 мм против контроля. Концентрацию ароматических кислот (С_.) найти по калибровочному графику.

Протеолитическую активность определяют по формуле:

А=2С (мкМ/мл мин)

В норме протеолитическая активность желудочного сока равна 0,15-0,5 мкМ/мл мин.

Эталоны ответов на тестовые задания

1.1. – Б

1.2. – В

2.1. – 1-Б,Д; 2-А,В,Г,Е

2.2. – А-5; Б-1; В-3; Г-2; Д-4

3.1. – 1, 3

3.2. – 2, 4

4.1. – В (+ + -)

4.2. – В (+ + -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Фонд свободных аминокислот организма наполняется из трех источников – белков пищи, белков собственных тканей и за счет синтеза из углеводов и кетоновых тел. Последний пункт справедлив только в отношении заменимых аминокислот.

Метионин и лизин относятся к незаменимым аминокислотам, т.е. аминокислотам, которые не могут быть синтезированы в организме. Если отсутствует хотя бы одна из неземенимых аминокислот, синтез белка прекращается, поэтому в условиях, когда пища не содержит какую-либо незаменимую аминокислоту (или аминокислоты), их единственным источником становятся белки собственных тканей, распад тканевых белков усиливается, что приводит к развитию отрицательного азотистого баланса.

Задача 2.

1. тир-вал-тир-лиз-ала-ала-фен-арг-асп-асп-три-ала-сер-мет-фен-арг

6_b 1 4 3 1 1 4 3 2 1 4 1 1 5_b

↓

сер-мет

2. ала-лиз-лей-глу-тир-ала-ала-асп-три-мет-фен-глу-асп-три-иле-гли

6_а 3 1 1 4 1 1 4 1 4 2 1 4 5_а

↓

ала-асп

1 – пепсин (расщепляет пептидные связи: Х-фен, Х-тир, Х-три, ала-ала, ала-сер, лей-глу)

2 – гастриксин (расщепляет пептидные связи, образуемые дикарбоновыми АК)

3 – трипсин (расщепляет пептидные связи: арг-Х; лиз-Х)

4 – химотрипсин (расщепляет связи: фен-Х; тир-Х; три-Х)

5а – карбоксипептидаза А (отщепляет с С-конца одну аминокислоту: ароматическую или алифатическую)

5б – карбоксипептидаза В (отщепляет с С-конца лиз или арг)

6а – аланинаминопептидаза ( отщепляют аланин с N-конца.

6б – лейцинаминопептидаза (отщепляет с N-конца любую аминокислоту)

7 – дипептидаза (расщепляют дипептиды)

Примечание: Х – любая аминокислота.

 

 

Занятие 33. Общие пути метаболизма аминокислот:

Переаминирование, дезаминирование,

Декарбоксилирование.

Цель занятия. Усвоить общие пути метаболизма аминокислот: переаминирование, дезаминирование и декарбоксилирование, а также их биологический смысл.

Содержание занятия:

– контроль выполнения заданий по самоподготовке;

– выполнение заданий тестового контроля;

– участие в выступлении и обсуждении реферативных сообщений;

– контроль усвоения темы путем устного собеседования с преподавателем;

– экспериментальное определение активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы.

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1. Аэробный рост бактерий на аминокислотах.

2. Факторы агрессии патогенных микроорганизмов.

3. Синтез незаменимых аминокислот микроорганизмами.

4. Окислительный путь катаболизма аминокислот.

Методические указания к самоподготовке

 

При подготовке к занятию, используя лекции, учебники и дополнительную литературу, ответьте на вопросы и выполните задания:

1. Напишите структуру алифатических моноаминомонокарбоновых аминокислот.

2. Напишите структуру аминокислот, содержащих в алифатическом радикале дополнительную функциональную группу (гидроксильную, серу).

3. Напишите структуру ароматических и гетероциклических аминокислот.

4. Напишите структуру диаминомонокарбоновых и моноаминодикарбоновых аминокислот.

5. Нарисуйте схему расщепления белка в клетках.

6. Вспомните структуру и биологическую роль лизосом в клетках.

7. Дайте определения термину «период полужизни белка».

8. Представьте общую схему процесса переаминирования с участием a-кетоглутаровой и глутаминовой кислот.

9. Напишите структурные формулы производных витамина В₆ и цепь реакций с их участием, раскрывающих молекулярный механизм переаминирования.

10. Напишите схему действия глутаматдегидрогеназы.

11. Продумайте биологический смысл переаминирования и его роль во взаимосвязи обмена аминокислот с углеводами, липидами, циклом трикарбоновых кислот.

12. Охарактеризуйте типы дезаминирования в живых системах.

13. Напишите реакции неокислительного дезаминирования треонина и гистидина.

14. Напишите реакции непрямого окислительного дезаминирования аланина и аспарагиновой кислоты.

15. Напишите реакции декарбоксилирования гистидина, триптофана, лизина, глутаминовой кислоты. Охарактеризуйте биологическое действие получаемых аминов.

16. Напишите схему инактивации аминов в организме.

17. Дополните и зарисуйте схему основных путей обмена аминокислот в клетке:

 

 

18. Зарисуйте в тетрадь следующую схему и впишите названия глюкогенных и кетогенных аминокислот:

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Задание 1. Выберите один наиболее правильный ответ.

1.1. В состав коферментов аминотрансфераз входит витамин....

А. В₁

Б. В₂

В. В_С

Г. В₅

Д. В₆

Е. В₁₂

1.2. Серотонин синтезируется из....

А. гистидина

Б. тирозина

В. триптофана

Г. пролина

Задание 2. Установите соответствие.

2.1.

1. кетогенные аминокислоты 2. глюкогенные аминокислоты 3. одновременно кетогенные и глюкогенные аминокислоты

А. аланин Б. триптофан В. лейцин Г. треонин Д. фенилаланин Е. лизин

2.2.

Вид дезаминирования	Реакция
1. Восстановительное 2. Гидролитическое: 3. Внутримолекулярное 4. Окислительное	А. В. Г. Д.

Задание 3. Выберите несколько правильных ответов.

3.1. …. являются производными этого соединения:

1. триптамин

2. дофамин

3. серотонин

4. ФАД, ФМН

5. аминомасляная кислота

3.2. Функции гистамина:....

1 – мощный физиологический стимулятор секреции HCl

2 – фактор расширения сосудов

3 – медиатор воспаления, аллергии, боли

4 – возбуждающий медиатор средних отделов мозга

5 – регулятор температуры тела, дыхания.

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите наличие причинной связи между ними.

4.1. Незаменимые аминокислоты могут синтезироваться в организме, потому что их синтезирует флора кишечника.

4.2. При шизофрении нарушен обмен серотонина, потому что снижена активность ДОФА-декарбоксилазы.

Примеры ситуационных задач

Задача 1.

При дезаминировании аланина образуется пировиноградная кислота. Каков энергетический эффект полного окисления аланина (в молях АТФ на моль кислоты)?

Задача 2.

Глутаминовая кислота в процессе окислительного дезаминирования превращается в α-кетоглутаровую. Каков энергетический эффект полного окисления 1 моля глутаминовой кислоты (в молях АТФ)?

Самостоятельная работа студентов

Занесите в тетрадь протоколы лабораторных работ, оставляя место для расчетов и выводов.

Работа 1. Колориметрический метод определения активности