Работа 1. Проба на сычужное действие пепсина.

Принцип метода

Пепсин при рН- 4.5-5.0 обладает сычужным действием – створаживает молоко. При наличии солей кальция образовавшийся при этом казеин выпадает в осадок в виде соли казеината кальция. При связывании солей кальция в молоке щавелевокислым аммонием и при инактивировании фермента кипячением створаживание молока под влиянием желудочного сока не происходит.

Ход определения

В 5 пробирок отмерить по 4 мл разведенного водой (1:1) молока, затем добавить в первую пробирку 1 мл прокипяченного желудочного сока, во вторую — 1 мл активного желудочного сока, в третью — 4-5 капель насыщенного раствора щавелевокислого аммония и 1 мл активного желудочного сока, в четвертую — 1 мл раствора СаСl₂, в пятую — 1 мл 0,025 и. раствора НС1. Все пробирки поместить в термостат при температуре 38°С на 15 минут. По истечении указанного времени пробирки вынуть, охладить и отметить, где произошло свертывание молока. К содержимому третьей пробирки добавить по каплям раствор СаС1₂ до выпадения осадка.

Работа 2. Определение активности пепсина и уропепсина.

Принцип метода

Метод основан на способности пепсина в определенных условиях расщеплять в белковой молекуле гемоглобина пептидные связи, образованные тирозином, фенилаланином и триптофаном. По концентрации последних судят о пептической активности желудочного сока или мочи. Около 2 % пепсиногена, вырабатываемого клетками слизистой оболочкой желудка, поступает в кровь и выводится почками с мочой в виде уропепсиногена.

Ход определения активности уропепсина

Из суточного количества мочи отбирают 20 мл, помещают в градуированный цилиндр, подкисляют раствором соляной кислоты до рН 1,5 и доводят дистиллированной водой до 25 мл. Таким же путем доводят раствор гемоглобина до рН 1,5. В пробирку отмеривают 1 мл подкисленной мочи, добавляют 5 мл 1% раствора гемоглобина и выдерживают на водяной бане при 37° в течение 30 мин. Затем добавляют 10 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, фильтруют и в фильтрате определяют ароматические аминокислоты. Для этого к 2 мл фильтрата добавляют 5 мл дистиллированной воды, 8 мл раствора щелочи и 3 мл реактива Фолина, предварительно разведенного водой в 3 раза. После добавления последнего развивается голубая окраска. Через 30 мин, на фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность при длине волны 580 нм. Опыт сравнивают с контролем.

Расчет

Содержание пепсиногена в суточном количестве мочи производят по формуле:

П_сут. = 20хДхVхХ (Ед/24 часа),

где Д — оптическая плотность исследуемой мочи; Х - количество тирозина в мг, которое определено по калибровочной кривой; V - объем мочи за 24 часа.

Определение активности пепсина в желудочном соке.

 

Производят аналогичным способом, с той лишь разницей, что для исследования берут 0,5 мл желудочного сока. Расчет производят на 100 мл желудочного сока.

 

Работа 3. Количественное определение активности

Уропепсина в моче по видоизмененному методу Веста.

 

В норме активность фермента составляет около 15-40 единиц. Определение содержания уропепсина имеет большое диагностическое значение, так как уровень выделения уропепсина отражает состояние секреторной функции желудка и изменяется параллельно с изменением кислотности желудочного сока. Увеличение активности уропепсина наблюдается при гиперацидном гастрите, язвенной болезни желудка; уменьшение – при гипоацидных гастритах, раке желудка, а также при заболеваниях желчных путей.

Принцип метода

Активированный в течение часа при 37°С соляной кислотой пепсиноген мочи (уропепсин) свертывает казеин молока. Активность уропепсина измеряется временем, необходимым для свертывания казеина. Мочу для исследования собирают за сутки или за определенный промежуток времени (2-3 часа).

Ход определения

В пробирку поместить 3,8 мл мочи, прибавить 0,2 мл 2 н. раствора НС1 и 1-2 капли 0,2 %раствора метилоранжа. Пробирку поместить в термостат при температуре 37°С на 1 час. По истечении указанного времени в пробирку быстро прилить 0,5 мл молочно-ацетатной смеси (к свежему коровьему молоку приливают равный объем ацетатного буфера, рН смеси равен 5,0). По секундомеру отметить время выпадения первых хлопьев.

Расчет

Активность уропепсина рассчитывается по формуле:

Х(Ед/час) = 10 × V

V_i × S × t

где V-весь объем мочи за данный промежуток времени; V_i-количество мочи, взятое для исследования; t-время, за которое была собрана вся моча; S-время свертывания молока.

Пример расчета:

Втечение 3 часов (t=3) у больного было собрано 140 мл мочи (V=140). Для анализа было использовано 3,8 мл мочи (V_i=3,8).

Первые хлопья казеина появились через 8 сек. после добавления молочно-ацетатной смеси (S=8).

Рассчитываем по формуле активность уропепсина:

Х = (10 × 140) / (3,8 × 8 × 3) = 15,3 Ед/час