Работа 2. Определение глюкозы в крови по

Цветной реакции с орто-толуидином.

Принцип метода

Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом.

Глюкоза при нагревании с о-толуидином в кислой среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови и определяется колориметрически на ФЭКе.

Ход определения

В центрифужную пробирку налить 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдуть на стенку пробирки 0,1 мл крови, взятой из пальца. Содержимое пробирки взболтать и центрифугировать 5-7 мин. при 1500 об/мин.

Взять две пробирки. В первую (опыт) прилить 0,5 мл центрифугата, во вторую (контроль) – 0,5 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и в обе пробирки добавить по 4,5 мл о-толуидинового реактива. Пробирки поместить на 8 мин. (точно!) в кипящую водяную баню и сразу охладить под водопроводной водой до комнатной температуры.

Опытную пробу колориметрировать против контроля или дистиллированной воды на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при красном (600-650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.

Расчет произвести по калибровочному графику или с применением стандартного раствора глюкозы.

Стандартную пробу проводят как опытную, но вместо крови используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 мМ (1,0 г/л), а в случае высокого содержания сахара в крови 16,65 мМ (3,0 г/л) или 27,75 мМ (5,0 г/л).

Расчет произвести по формуле:

С_оп^:= (С_сг х Е_оп) / Е_ст = мМоль глюкозы или г/л глюкозы, где

С_оп - концентрация глюкозы в опытной пробе,

С_ст - концентрация глюкозы в стандартной пробе в мМ или г/л,

Е_оп - оптическая плотность опытной пробы,

Е_ст - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.

В норме содержание глюкозы в крови составляет 3,33-5,55 мМоль или 0,6-1,0 г/л. Гипергликемия наблюдается после приема пищи, содержащей большое количество сахара (алиментарная гипергликемия), а также при клинически выраженной форме сахарного диабета. Гипогликемия наблюдается после инъекций инсулина и при некоторых формах гликогенозов.

Работа 3. Определение активности альфа-амилазы

В сыворотке крови и моче.

Принцип метода

Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.

Ход определения

Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:

Компоненты	Пробы крови, мл	Пробы мочи, мл
опытная	контрольная	опытная	контрольная
Суспензия субстрата
	Инкубация в течение 5 мин. при + 37^оС
Сыворотка крови	0,10	-	-	-
Моча	-	-	0,05	-
Дистиллированная вода	-	0,10	-	0,05
	Инкубация в течение 15 мин. при + 37^оС
Осаждающий раствор
Активность амилазы		Норма: 130-150 Е/л		Норма 1,00-2,00 Е/мл

 

Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.

Активность фермента находят по калибровочному графику.

У человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.

У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче - от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят также заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.