Работа 1. Количественное определение активности

Амилазы слюны по Вольгемуту.

 

Амилаза (диастаза) – фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы (химизм реакции см. занятие №7). Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой слюнные и поджелудочная железы. Амилаза содержится также и в крови, куда попадает, главным образом, из поджелудочной железы.

Принцип метода

Метод основан на том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и тоже количество раствора крахмала и находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала. Затем производят перерасчет активности фермента на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны или амилокластичекая сила слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в мл, которое может расщепляться 1 мл слюны при температуре 38⁰ в течении 30 мин.

В норме амилазная активность слюны составляет 160-320 ед.

Ход работы

В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В 1 пробирку добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз. Содержимое пробирки перемешивают и 1 мл раствора переносят из 1 пробирки во 2, перемешивают и из второй – таким же образом в 3 и т.д. до 10 пробирки. Из 10 пробирки 1 мл смеси выливают. Таким образом, получается ряд разведенной слюны, в котором в каждой последующей пробирки содержится фермент вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешивают и помещают пробирки в термостат на 30 мин при температуре 38⁰.

Через 30 минут пробирки вынимают, охлаждают, добавляют по 1-2 капле 1% раствора йода и перемешивают. Жидкость в пробирках в зависимости от степени расщепления крахмала может окрашиваться в желтый, розовый, красный и фиолетовый цвет. Раствор желтого цвета свидетельствует о полном расщеплении крахмала, фиолетовый – о том, что крахмал в растворе еще сохранился.

Работу необходимо оформить в виде таблицы:

Разведение слюны Кол-во 0,1% крахмала Окрашивание йодом Амилокластическая активность слюны	№ пробирки

Расчет

Берется количество слюны в последней пробирке с желтой окраской. Если это четвертая пробирка, то разведение слюны в ней – 160 раз. Составляется следующая пропорция: 160 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1% р-ра крахмала, а 1 мл слюны – Х мл 0,1% р-ра крахмала.

Работа 2. Фотоколориметрический метод исследования

Активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови

По Севелу и Товареку.

Принцип метода. Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови. Пируват с 2,4- динитрофенилгидразином образует соответствующий гидразон, имеющий красно-бурое окрашивание в щелочной среде, интенсивность которого прямо пропорциональна содержанию кетокислоты:

2,4-динитрофенолгидразон ПВК

Ход определения

Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора 0,3% НАД ⁺ и ставят на 5 мин в водяную баню при 37⁰С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 37⁰С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл 0,0198% раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл 8% раствора гидроксида натрия, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1см. Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет

Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Рассчитайте активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделайте вывод о возможных причинах изменений активности фермента.

Практическое значение работы

Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8-4,0 ммоль/(ч·л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.