Занятие 8. Кинетика ферментативных реакций.

Количественное определение активности некоторых ферментов.

Изоферменты.

Цель занятия. Усвоить узловые вопросы ферментативной кинетики. Научиться проводить количественное определение активности ферментов: амилазы слюны, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы и ее изоферментов; интерпретировать полученные результаты.

Содержание занятия:

– контроль выполнения заданий по самоподготовке;

– выполнение заданий тестового контроля;

– решение ситуационных задач;

– определение активности некоторых ферментов по выбору преподавателя: амилазы слюны, щелочной фосфатазы, изоферментов лактатдегидрогеназы в сыворотке крови;

– прослушивание и обсуждение реферативных сообщений;

– контроль усвоения темы путем устного собеседования с преподавателем.

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1. Общие методы определения активности ферментов.

2. Регуляция активности ферментов.

3. Изоферменты.

Методические указания к самоподготовке

 

Для усвоения темы, пользуясь лекциями и учебниками, ответьте на предложенные вопросы и выполните следующие задания:

1. Напишите вывод константы Михаэлиса, объясните ее физический смысл.

2. Покажите зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата:

а) напишите уравнение Михаэлиса-Ментен;

б) дайте анализ уравнения;

в) зарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента по Михаэлису-Ментен;

г) напишите уравнение Лайнуивера-Берка и его графическое выражение.

3. Что такое энергия активации? Зарисуйте график, объясняющий явление катализа с термодинамических позиций.

4. Схематически представьте строение активного центра ацетилхолинэстеразы. Разберите механизм ее действия.

5. Охарактеризуйте изоферменты, дайте определение терминам «изоферменты» и «множественные формы ферментов».

6. Приведите примеры ферментов, имеющих изоферментный спектр.

7. Объясните, каков биологический смысл того, что многие регуляторные ферменты имеют изоферменты. Приведите примеры.

8. Напишите, сколько изоферментов имеют лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и креатинкиназа, дайте характеристику каждому из них.

9. Объясните, какое диагностическое и прогностическое значение имеет определение изоферментного спектра ферментов сыворотки крови.

10. Укажите, на каком свойстве ферментов основано определение их активности.

11. Какими методами можно следить за превращением субстрата и образованием продуктов реакций при действии амилазы слюны и фосфатазы в сыворотке крови.

12. Напишите, что принимается за единицу каталитической активности фермента. Что такое катал, международная единица активности?

13. Напишите, что называется числом оборота или молекулярной активностью, удельной активностью фермента.

14. В каких условиях производят измерение активности ферментов?

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Задание 1. Выберите один наиболее верный ответ.

1.1. Гексокиназа катализирует реакцию фосфорилирования гексоз. Кm гексокиназы для аллозы составляет 8´10^-3 моль/л, а для маннозы – 5´10^-6 моль/л. Какой из субстратов будет фосфорилироваться с наибольшей скоростью, если их концентрация в среде инкубации одинакова и составляет 8´10^-7 моль/л?

а) аллоза

б) манноза

в) скорость превращения обоих субстратов будет одинакова

г) имеющиеся данные не позволяют ответить на поставленный вопрос

1.2. Молярная активность (число оборотов) ферментов выражается в...

а) моль/мг мин

б) моль/сек

в) моль/ моль сек

г) моль/кг сек

Задание 2. Установите соответствие.

2.1.

Регуляция активности фермента:	Механизм регуляции:
1) увеличение количества ферментативного белка	а) взаимодействие с белковыми ингибиторами
2) уменьшение активности протеиназ	б) действие протеинкиназ
3) модификация ферментативной активности в результате фосфорилирования белка	в) индукция генов
4) активация проферментов	г) ограниченный протеолиз

2.2.

Один из вариантов решения уравнения Михаэлиса:	Необходимое условие:
1) V = Vmax	а) Кm > [S]
2) V = Vmax/2	б) [S] > Кm
3) V = k [S]	в) [S] = Кm

Задание 3. Выберите несколько правильных ответов.

3.1. Изоферменты – это белки, ….

1 - состоящие из нескольких субъединиц

2 - состоящие из одной субъединицы

3 - отличающиеся друг от друга по степени активности

4 - отличающиеся друг от друга по аминокислотному составу и последовательностью

5 - отличающиеся различной локализацией в тканях и органах

3.2. Между активным центром холинэстеразы и ацетилхолином в ходе ферментативной реакции возникают … связи.

1 - гидрофобные

2 - дисульфидные

3 - водородные

4 - электростатические

5 – ковалентные

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите наличие причинной связи между ними.

4.1. Константа Михаэлиса является основной характеристикой ферментативной реакции, потому что она характеризует сродство фермента к субстрату.

4.2. Пять изоформ лактатдегидрогеназы катализируют одну и ту же реакцию, потому что имеют четвертичную структуру.

Примеры ситуационных задач

Задача 1.

Фермент (10мкг) с молекулярной массой 500.000 г/моль превращает 9,6 мкмоль субстрата в минуту при температуре 25°С. Подсчитайте число оборотов.

Задача 2.

Сколько граммов субстрата с молекулярной массой 672 г/моль может преобразовать фермент, если его активность составляет 5 нКат, а время инкубации – 20 сек.

Самостоятельная работа студентов

Занесите в тетрадь протоколы лабораторных работ, оставляя место для расчетов и выводов.