Работа 1. Влияние активаторов и ингибиторов на активность

Амилазы слюны.

 

Целью данной работы является установление усиливающего и ингибирующего влияния различных ионов на каталитическую активность ферментов. Так, например, ионы натрия и хлора стимулируют активность амилазы слюны, а ионы меди, наоборот, тормозят ее.

Ход работы

В три пробирки налить по 10 мл разведенной в 10 раз слюны. В первую пробирку добавить 1 мл 1% раствора NaCl, во вторую-1 мл 1% раствора CuSО₄, в третью- 1 мл дистиллированной воды (контроль). После этого в каждую пробирку прилить по 4 мл 0,5% раствора крахмала, пробирки встряхнуть и поместить в водяную баню или в термостат с температурой 38⁰С на 10 мин. После истечения указанного времени с содержимым каждой пробирки проделать качественную реакцию на крахмал и пробу Троммера. Полученные результаты занести в таблицу:

 

№ п/п

Субстрат

Фермент

Добавляемое вещество

Проба на крахмал

Проба Троммера

Вывод

Работа 6. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназной

Активности.

Принцип метода

Основан на изменение окраски метиленовой сини при восстановлении его в ходе дегидрогеназной активности. При дегидрировании янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой акцептором водорода является метиленовая синь, которая при восстановлении обесцвечивается. Чем быстрее обесцвечивается метиленовая синь, тем выше активность сукцинатдегидрогеназы. Ингибирование фермента замедляет скорость обесцвечивания метиленовой сини.

Ход работы

В три пронумерованные пробирки поместить 3-4 капли мышечной кашицы и добавить: в первую – 0,8 мл воды, во вторую – 0,2 мл 1% раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, в третью – 0,8 мл 1% раствора малоновой кислоты. Во все три пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора янтарной кислоты и по 1 капле 1% раствора метиленовой сини. После перемешивания добавляют по 3 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 37⁰С. Через 5 мин наблюдают изменение окраски раствора. Сравнить степень уменьшения голубого окрашивания в 3-х пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

В основе метода ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата, который представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой (обычно используют пероксидазу хрена либо другие пероксидазы).

Конъюгат может быть получен с использованием поликлональных антивидовых антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или моноклональных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (M, G, А).

В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M).

Для проведения анализа используют различные схемы ИФА:

1 – прямой; 2 – конкурентный; 3 – «сэндвич».

Прямой ИФА

1 – вносят антиген в 0,05 М натрий-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,2) на полистироловый 96-ти луночный планшет (по 50 мкл в лунку), в концентрации 10 мкг/мл;

2 – вносят 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA 10) по 100 мкл в лунку;

3 – вносят исследуемые антитела в буферный раствор с добавлением 0,05%-ного твина (PBSТ) по 50 мкл в лунку;

4 – вносят конъюгат кроличьих антител против IgG мыши конъюгированных с пероксидазой хрена (ПХ) по 50 мкл в лунку в буферном растворе PBSТ (рабочее разведение 1: 1000);

5 – вносят субстрат: раствор ортофенилендиамина (ОФД) – 5 мг на 10 мл 0,05 М цитратного буфера, рН 4,5, с добавлением 5 мкл 30% перекиси водорода, по 100 мкл в лунку;

6 – через 5-30 минут инкубации (после развития желто-коричневой окраски) для остановки реакции вносят 5% серную кислоту по 50 мкл в каждую лунку.

После каждого этапа (за исключением 5) планшеты с соответствующими растворами инкубируют при 37^oС в течение 1 часа. После 2, 3 и 4 этапов планшеты отмывают 6-10 раз холодной водой и трижды раствором PBSТ.

Результаты учитывают на спектрофотометре “Multiskan” при длине волны 492 нм, оптическом пути 3 мм (соответствует 100 мкл раствора в лунке 96-ти луночного планшета).

Конкурентный ИФА

В конкурентном ИФА на 3 этапе вместе с конъюгированными с ПХ антителами, вносят исследуемый антиген.

Остальные этапы проводят аналогично – как в непрямом ИФА.

 

 

Сэндвич» ИФА

В "сэндвич" ИФА на первом этапе вносят раствор антитела, на третьем этапе – растворы антигенов, на четвертом – конъюгат поликлональных кроличьих антител с ПХ.

Остальные этапы проводят аналогично – как в непрямом ИФА.

 

Во всех схемах используются следующие условные обозначения:

Эталоны ответов к тестовым заданиям

1.1. – 3

1.2. – 3

2.1. – 1-В; 2-А; 3-Б; 4-Г

2.2. – 1-А; 2-В; 3-Б; 4-Г; 5-Д

3.1. – 2,4

3.2. – 1,2,3

4.1. – Д (- + -)

4.2. – С (+ - -)