Работа 5. Осаждение белков концентрированной

азотной кислотой (проба Геллера).

 

Выпадение белка в осадок при действии некоторых минеральных кислот связано с дегидратацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кислотами.

В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Поэтому реакция осаждения белков азотной кислотой распространена при клинических исследованиях мочи (проба Геллера).

Ход работы

К 1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки, наклонив ее под углом 45⁰ так, чтобы обе жидкости сразу не смешивались, наслоить равный объем раствора белка.

На границе двух жидкостей образуется осадок в виде белого кольца.

 

Работа 6. Количественное определение белка в моче по методу

Робертса-Стольникова-Брандберга.

 

В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспериментально установлено, что при наслаивании на азотную кислоту, растворы, содержащие 0,0033% белка, дают белое колечко в промежутке между второй и третьей минутами после наслаивания. Если колечко появляется непосредственно после наслаивания раствора белка на азотную кислоту, то путем последовательного разведения исследуемого материала достигают такого максимального разведения, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Умножая разведение на 0,0033%, получается процентное содержание белка в моче.

Ход работы

Заготовить 2 ряда пробирок (по 8 в каждом). Во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл концентрированной азотной кислоты.

В пробирках второго ряда развести исследуемую мочу методом кратных разведений. Для этого в первую пробирку этого ряда налить по 1 мл исследуемой мочи, во вторую и все последующие - по 1 мл дистиллированной мочи.

После перемешивания из второй пробирки перенести 1мл жидкости в третью, затем после перемешивания такой же объем из третей пробирки перенести в четвертую и т.д. до конца ряда. Из последней пробирки 1мл жидкости вылить. Таким образом, получается следующий ряд разведений исследуемой мочи: в первой пробирке моча исходной концентрации, во 2-ой – разведена в 2 раза, в 3-ей – в 4 раза, в 4-ой – в 8 раз, в 5-ой - в 16, в 6-ой - в 32, в 7-ой – в 64, в 8-ой – в 128.

После разведения мочи произвести поочередное наслаивание содержимого каждой пробирки на концентрированную азотную кислоту. По секундомеру отметить, в какой пробирке белое кольцо образовалось через 2-3 минуты после начала опыта.

Примерный расчет:

Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1:16.

Следовательно, концентрация белка в исходной порции мочи равна:

0,0033% × 16 = 0,05%

Эталоны ответов к тестовым заданиям

 

1.1. – А. – б; Б. – а

1.2.– г (включение пролина вызывает изгиб полипептидной цепи, делая невозможным вращение вокруг связи между a-углеродным атомом и азотом иминогруппы)

2.1. – 1-а, 2-б, 3-в, 4-г; 5-е, 6-ж, 7-д

2.2. – 1-г, 2-в, 3-б, 4-а

3.1. – 4

3.2. – 4

4.1. – Д (- + -)

4.2. – Е (- - -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1.

Аминокислотный состав пептида отличается высоким содержанием диаминомонокарбоновых кислот – лизина и аргинина, в то же время, в структуре пептида отсутствуют ароматические и гетероциклические аминокислоты - фенилаланин, тирозин, гистидин и триптофан, дающие положительную ксантопротеиновую реакцию.

В частности, тирозин с концентрированной азотной кислотой реагирует по следующей схеме:

Оранжевая окраска

Задача 2.

В живой клетке процесс укладки синтезируемой полипептидной цепи – фолдинг регулируется особыми белками шаперонами, называемыми также белками теплового шока. Эти белки контролируют формирование стабильной и биологически активной конформации, предотвращая образование из полипептидной цепи неспецифических клубков и агрегатов, а также участвуют в доставке белков к субклеточным мишеням.