Определение активности псевдохолинэстеразы сыворотки крови колориметрическим методом.

 

Значение метода: определение сывороточной псевдохолинэстеразы имеет важное значение, как метод функционального исследования печени. Этот фермент синтезируется в клетках печени и относится к группе секреторных ферментов. При нарушении белоксинтезирующей активности печени, содержание фермента в сыворотке крови сокращается.

Принцин метода: метод основан на фотометрическом определении концентрации уксусной кислоты, образованной при гидролизе ацетилхолинхлорида ацетилхолинэстеразой сыворотки крови.

Ход работы:

1 этап. В 2 пробирки (опыт и контроль) разливают 2,5 мл вероналового буфера с индикатором феноловым красным (рН 8,4) приливают 0,05 мл сыворотки крови и прогревают 5 минут в термостате при 37 градусах Цельсия.

2 этап. В обе пробирки приливают 0,1 мл (2-3 капли) ацетилхолинхлорида.

В контрольную пробу добавляют 2-3 капли прозерина (ингибитор фермента) и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

3 этап. После инкубации сразу же в опытную пробу добавляют 0,1мл (2-3 капли) прозерина, ингибитора фермента. Смесь охлаждают при комнатной температуре.

4 этап. Производят измерение оптической плотности опытной пробы против контроля на ФЭКе в кювете на 0,5 см при зеленом светофильтре. Окраска устойчива в течение часа.

Расчет: из показателя оптической плотности холостой пробы вычитают показатель оптической плотности опыта и по калибровочному графику находят активность фермента, которая выражается в микромолях уксусной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки крови в течении часа при 38 градусах Цельсия.

Норма: 160-340 мкМ./ час.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ.

Принцип метода: Под действием фермента сыворотки крови бета - глицерофосфат подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфата, по которому судят об активности данного фермента.

Ход определение: Тщательно сполостнуть дистиллированной водой пробирки и воронки.

 

РЕАКТИВЫ	ОПЫТ	КОНТРОЛЬ
1.Раствор бета-глицерофосфата	1мл	1мл
2. Сыворотка	0,1мл инкубация 30 мин при 37градусах	-
3. ТХУ-10%	1мл	1мл
4.СЫВОРОТКА	-	0,1 мл
Тщательно перемешать и фильтровать через смоченный дистиллированной водой фильтр. К фильтрату добавить:
5. Молибденовый раствор	1мл	1мл
6. Раствор аскорбиновой кислоты	1мл	1мл
Перемешать и через 10 мин. колометрировать контроль и опыт против Н20 (красный светофильтр, кюветы 5 мл).   РАСЧЕТ: Из коэффициента светопоглощения опыта (Е оп) вычесть коэффициент светопоглощения контроля (Е контр). Разность посмотреть по калибровочному графику. В норме активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови взрослых 1,0-6,0 мм/час л., у детей до 6лет 2,5-15 мм/час до 16 лет 5,0-30,0 мм/час л.

 

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В МОЧЕ АМИЛОКЛАСТИЧЕСКИМ СПОСОБОМ.

Значение метода: Диастаза (альфа-амилаза) является экскреторным ферментом. Наиболее богаты амилазой поджелудочная и слюнные железы. В норме активность этого фермента в крови сравнительно невелика в связи с тем, что амилаза-низкомолекулярный белок, она проходит через почечный фильтр и определяется в моче. Повышение амилазной активности мочи прежде всего связывается с повреждением клеток поджелудочной железы (увеличение проницаемости мембран, некротизированных клеток, нарушение оттока секрета в 12-перстную кишку). Так, при остром панкреатите амилазная активность мочи может увеличиться в 10-30 раз. Повышение амилазной активности мочи, но в меньшей степени, может сопровождать воспаление слюнных желез (острый паротит). Снижение активности амилазы в плазме крови наблюдается при уменьшении синтеза фермента при снижении функции поджелудочной железы, склерозировании органа.

Принцип метода: Основан на фотометрическом измерении падения концентрации крахмала в результате ферментативного гидролиза.

Ход работы:

РЕАКТИВЫ ОПЫТ КОНТРОЛЬ

1. Крахмал 2% 0,5 нагрев 0,5 нагрев

2.Фосфатный буфер 0,3 10 мин 0,3 10 мин

3. Nа СI 3% 0,1 при 37градусах 0,1 при 37 градусах

 

 

4.НСI (1Н) --- инкубировать 0,1 инкубировать

5.Моча 0,1 30 мин - 30 мин

6.Н20 при 37 градусах 0,1 при 37 градусах

 

Реакцию ОПЫТА прерывают прибавлением 0,1мл НСI

По 0,2 мл содержимого пробирок ОПЫТА и КОНТРОЛЯ переносится в разные колбы емкостью 50 мл. В каждую из колб прибавляют примерно по 40 мл воды, 0,5 НСI и 0,1 мл раствора йода и доливают до метки дистил. водой. Еоп и Е контр измеряют на ФЭКе при красном светофильтре с толщиной кюветы 1см, против воды. Амилазную активность мочи выражают через количество мг крахмала, гидролизованного амилазой, содержащей в 1мл мочи за 60 мин при 37 градусах.

Расчет

Е контр-Еоп * 10 * 20 *10

Хмг крахмала= ----------------------------

Еконтр

Где: Е-экстинкция или коэффициент

10-количество мг крахмала, введенного в опытную и контрольную пробы.

20-коэффициент перерасчета на 1мл биологической жидкости за час инкубации.

10-разведение мочи

Норма: 80-160 мг крахмала, гидролизованного 1мл биологической жидкости за час инкубации при 37 градусах Цельсия.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ О-ТОЛУИДИНОВЫМ МЕТОДОМ.

Принцип метода: Альдогексозы (глюкоза, галактоза, ксилоза) при нагревании с орто- толуидином в кислой среде дают синезеленое окрашивание, интенсивность которого определяется колометрически.

Ход работы: 0,2мл сыворотки крови (спинномозговой жидкости) вносят в пробирку с 2мл 6% ТХУ. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. К фильтрату приливают 2мл. О-толуидинового реактива и ставят на 8 минут в кипящую баню. После охлаждения (15 мин) фотометрируют при красном светофильтре. В качестве контроля используется вода. Параллельно определяют светопоглощение стандартного раствора глюкозы (0,05мл глюкозы) обработанного так же, как и опытная проба.

 

А

Расчет: ------ х 200 = мг %

Б х 4

 

А-светопоглошение образца

Б-светопоглощение раствора глюкозы (800 мг на 100мл)

Норма: кровь –70-110мг %, плазма-60-100мг %, спинномозговая жидкость-45-70мг %.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ (ПО ОКИСЛЕНИЮ ФЕНОЛФТАЛЕИНА).

Принцип метода:

В-d глюкоза + в-d глюкозооксидаза глюколактон + ФАДН2

-------------------------

ФАД

 

 

ФАДН2+О2 = ФАД +Н2О2

 

 

Образующаяся перекись водорода в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина, который в щелочной среде окрашен в красный цвет.

Ход работы: 0,2 мл сыворотки крови вливают в 2мл 5% ТХУ, перемешивают и фильтруют через смоченный водой фильтр. К фильтрату прибавляют 2мл 0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли раствора глюкозооксидазы. Перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем добавляют 2 мл рабочего реактива и через 10мин. фотометрируют в кюветах толщиной 1 см при зеленом светофильтре против дистилированой воды.

Количество глюкозы в сыворотке определяется по калибровочному графику.

Норма: 3,5-5,7 ммоль/л.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8

КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРА В МОЧЕ - РЕАКТИВ НИЛАНДЕРА.

Реакция Ниландера относится к окислительно-восстановительным методам определения сахара. Она основана на окислении глюкозы солью висмута Вi (NO3)2 в щелочной среде. При кипячении, в случае наличия сахара в моче, выпадает черный осадок

металлического висмута.

 

O

|| 2+ ОН

R-C-H + Bi ----------------® R- COOH + Bi

t

 

 

Ход работы:

К 1-2 патологической мочи прибавляют 0,5-1мл реактива Ниландера и кипятят 2 мин.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №9

ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕТА- ЛИПОПРОТЕИДОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПО БУРШТЕЙНУ И САМАИ.

Значение метода: По изменению липопротеидов сыворотки можно судить о различных патологических процессах организма человека. Увеличение содержания бета-липопротеидов- наиболее часто встречающееся в липограмме отклонение от нормы. Оно отмечается при атеросклерозе, внутрипеченочном холестазе, механической желтухе, диабете, при резких гипопротеинемиях, гликогенозах, ксантоматозе и др. Увеличение бета-липопротеидов в крови тесно связано с гиперхолестеринемией, поскольку холестерин входит в состав, главным образом, бета-липопротеидов.

Принцип метода: Метод основан на избирательном осаждении бета-липопротеидов с помощью гепарина в присутствиии ионов Са. Введение гепарина в присутствии Са вызывает связывание бета-липопротеидов и помутнение раствора, оптическую плотность которого можно измерить на ФЭКе. Степень помутнения соответствует концентрации бета-липопротеидов.

Ход работы: К 2мл 0,025М р-ра СаСI2 добавляют 0,2 мл сыворотки крови и оптическую плотность р-ра определяют на ФЭКе (Е1) в кювете толщиной 0,5 см с красным светофильтром против воды. Затем в кювету добавляют 0,04мл 10% р-ра гепарина и содержимое перемешивают. Бета-липопротеиды образуют комплекс с гепарином, дающий помутнение р-ра. При этом оптическая плотность увеличивается (Е2). Определяют точно через 4мин после добавления гепарина. Разница Е1 – Е2 приходится на оптическую плотность, обусловленную липопротеидами. Количественную оценку проводят по калибровочному графику и выражают в мг%.

Норма 300-400мг% (3-6 г/л).

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №10

1. РЕАКЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ИОДОФОРМА (НА АЦЕТОНОВЫЕ ТЕЛА).

 

1мл. мочи + 1мл. NаОН + 5 капель I2 в КI = желтое окрашивание.

 

 

2. ПРОБА С ХЛОРНЫМ ЖЕЛЕЗОМ.

 

1мл. мочи + 5 капель хлорного железа = вишнево- красное окрашивание.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

(МЕТОД ИЛЬКЕ).

Значение метода: Холестерин может накапливаться в крови в больших количествах при нарушении жирового обмена. Длительная гиперхолестеринемия при измененных условиях растворимости холестерина приводит к развитию атеросклероза. Гиперхолестеринемия наблюдается при механической желтухе, нефрите и нефрозах, гипотериозе, авитаминозе группы «В». Очень высокое содержание холестерина в крови наблюдается при сахарном диабете, липоидном нефрозе. Гипохолестеринемия обнаружена при анемиях, лихорадочных состояниях, сыпном тифе, голодании, гипертиреозе, раковой кахексии, поражении ЦНС.

Принцип метода: Холестерин в присутствии смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и конц. серной кислоты в соотношении 1:5:1 (реактив Ильке) превращается в сульфокислоту холестерина зеленого цвета.

Ход работы: в сухую пробирку к 2 мл реактива Ильке добавить 0,1 мл сыворотки. Сыворотку вносить медленно по стенке пробирки. Затем встряхивают содержимое пробирки и помещают в темное место на 20 мин. Окрашенную в зеленный цвет жидкость колориметрируют на ФЭКе, применяя красный светофильтр в кювете 0,5см. Контроль при фотометрировании - реактив Ильке. Содержание холестерина определяется по калибровочному графику.

В норме содержание холестерина 3,5-6,8 мМоль или 116-242 мг %

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №12

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ КИСЛОТНОСТИ, ОБЩЕЙ СОЛЯНОЙ КИСЛОТЫ, СВОБОДНОЙ СОЛЯНОЙ КИСЛОТЫ В ОДНОЙ ПОРЦИИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА.

Значение метода: При клиническом анализе желудочного содержимого важнейшее значение имеет содержание кислот. Повышенная кислотность может указывать на язвенную болезнь и (или) 12-перстной кишки, гиперацидный гастрит. Пониженная кислотность встречается при ряде желудочно-кишечных заболеваний (гипоацидный гастрит), раке желудка. Кислоты желудочного сока, всасываясь в кровь, играют большую роль в кислотно-щелочном равновесии организма.

Принцип метода: Определение общей кислотности, свободной и связаной соляной кислоты проводят титрованием желудочного содержимого щелочью, с применением индикатора, которые в зависимости от рН среды меняют окраску, индикатор фенолфталеин (индикатор на общую кислотность) в кислой среде остается бесцветным, а в щелочной окрашивается в розовый цвет. Индикатор диметиламиноазобензол в присутствии свободной НСI окрашивается в ярко-красный цвет, в ее отсутствии дает желтое или оранжевое окрашивание. Зона перехода фенолфталеина лежит в пределах рН 8,2-10, а диметиламиноазобензола рН 2,9-4,0.

Ход работы: Отмеривают пипеткой в колбочку 10 мл. Профильтрованного желудочного сока и добавляют 1-2 капли диметиламиноазобензола и 2 капли фенолфталеина. Титруют 0,1Н раствором NаОН до цвета красной рыбы, т.е желтовато-красной окраски. Первая точка. Затем продолжают тирование до лимонножелтого цвета. Вторая точка. И, наконец, до розового окрашивания. Т ретья точка.

Расчет:

Свободная НСI = Количество NаОН в 1 точке умноженное на 10.

Общая НСI= Количество NаОН во 2 точке + Количество NаОН в 3 точке: 2 * 10

 

Связанная НСI= Общая НСI- Свободная НСI

Общая кислотность= Количество NаОН в 3 точке умноженное на 10.

Норма

Общая кислотность желудочного сока 40-60Ед

Свободная НСI-20-40 Ед

Кислотность желудочного содержимого выражается в титрационных единицах – количестве 0,1 р-ра NаОН, пошедших на титрование 100мл желудочного сока.

(для опыта взято 10мл желудочного сока, поэтому умножают на 10).