Определение групп крови моноклональными антителами

Для определения групп крови этим способом используют моноклональные антитела, которые получают с помощью гибридомной биотехнологии.

Гибридома – это клеточный гибрид, образованный путем лимфоцитом, который синтезирует специфические моноклонажльные антитела.. гибридома обладает способностью к неорганиченному росту, характерна для опухолевой клетки и присущей лимфоциту способностью синтезировать антитела.

Разработаны стандартные реагенты-моноклональные анттела (МКА): цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны представляют собой лиофилизированный порошок красного (анти-А) и синего (анти-В) цвета, который разводят изотоническим раствором хлорида натрия непосредственно перед пробой.

Техника проведения.

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с каплями антител следует нанести по одной маленькой капле исследуемой крови. После перемешивания компонентов наблюдают за реакцией агглютинации в течение 2 – 3 минут. Оценка результатов очень проста (табл. 5).

Определение групповой принадлежности крови может сопровождаться ошибками, которые ведут к неправильной трактовке результатов. Можно выделить три основные группы ошибок: ошибки, связанные с низким качеством реагентов; технические ошибки; ошибки, связанные с особенностями исследуемой крови. Первых двух можно избежать, строго

 

Схема оценки результатов определения групп крови

С помощью моноклональных антител

(цоликлоны анти-А и анти-В)

Таблица 5

 

Наличие агглютинации при реакции с цоликлоном	группа крови
Анти-А	Анти-В
- + - +	- - + +	0 αβ (І) Аβ (ІІ) Вα (ІІІ) АВ0 (ІV)

 

соблюдая описанные выше требования к сывороткке, условиям проведения реакции и др. Третья группа связана с явлением неспецифической панагглютинации (феномен Томсена), сущность которого состоит в том, что сыворотка пр комнатной температуре дает агглютинацию со всеми эритроцитами, даже со своими собственными (аутоагглютинация), а эритроциты в то время дают агглютинацию со всеми сыворотками, даже с сывороткой группы АВ. Подобное явление описано при ряде заболеваний: болезнях крови, спленомегалии, циррозе печени, инфекционых заболеваниях и др. Описана также панагглютинация и аутоагглютинация у здоровых людей.

Явление панагглютинации и аутоагглютинации наблюдается только прикомнатной температуре. Если определение групповой принадлежности проводить при температуре 37⁰ С, они исчезают.

Нужно строго помнить, что во всех случаях или сомнительного результата следует провести повторное определение групп крови при помощи стандартных сывороток других серий, а также перекрестным способом.

 

Способы определения резус-фактора

Методы определения резус-фактора делятся на применяемые в клинике, не требующие специального лабораторного оснащения, и лабораторные способы.

Существует два способа определения резус-фактора в клинике (так называемые экспресс-методы):

- экспресс-метод со стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева;

- экспересс-метод на плоскости без подогрева.

Для первого способа может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца или из вены непосредственно перед исследованием, консервированная кровь без предварительной обработки, атакже эритроциты из пробирки после формирования сгустка и остаивания сыворотки.

Методика проведения реакции.

Для исследования понадобятся центрифужные пробирки не менее 10 мл в объеме. На дно пробирки наносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ (ІV), содержащую 33% раствор полиглюкина. Затем туда добавляют каплю исследуемой крови или эритроцитов. После этого содержимое размазывают по внутренней поверхности пробирки круговыми вращениями пробирки, добиваясь, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию. Агглютинация наступает обычно в течение первой минуты, но наблюдать следует не менее 3 минут, чтобы успел образоваться устойчивый комплекс «антиген-антитело» и агглютинация проявилась отчетливо.

После этого в пробирку добавляют 2 – 3 мл физиологического раствора и перемешивают путем однократного или двукратного перевертывания пробирки, но ни в коем случае не взбалтывая ее.

Крупные хлопья на фоне просветленной жидкости, свидетельствующие об агглютинации, указывают на резус-паложительную принадлежность крови. Гомогенно окрашенная розовая жидкость в пробирке указывает на остутствие агглютинации и на резус-отрицательную принадлежность крови.

 

Методика определения резус-фактора

На плоскости без подогрева

На белой пластинке со смачиваемой поверхностью пишут фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. На левом краю пластинки делается надпись «сыворотка-антирезус», на правом – «контрольная сыворотка». Контрольной сывороткой служит сыворотка грыппы АВ (ІҮ), разведенная альбумином, не содержащая антител. В соответствии с надписями на пластинке помещают по 1 – 2 капли (0,05 – 0,1) реактива и резуконтрольной сыворотки. К обеим каплям добавляют исследуемые эритроциты. Кровь размешивают с реактивом сухой стеклянной палочкой, размазывая ее на пластинке до образования капли диаметром 1,5 см. Пластинку слегка покачивают. Через 3 – 4 минуты для сниятия возможной неспецифической агглютинации в каждую каплю добавляют 5 – 6 капель физиологического раствора. После этого пластинку покачивают в течение 5 минут.

Наличие хорошо выраженной агглютинации в капле свидетельствует о резус-положительной принадлежности крови, отсутсвие агглютинации (гомогенная окраска) – о резус-отрицательной.

 

Пробы на индивидуальную совместимость

Пробы на индивидуальную совместимость проводятся в процессе подготовки к гемотрансфузии. Ставят две реакции: пробу на индивидуальную совместимость по системе АВО и по резус-фактору. Предварительно для постановки реакций у реципиента из вены берут кровь, которую разделяют на сгусток и сыворотку (отстаиванием или центрифугированием).

а) Проба на индивидуальную совместимость по системе АВО

На белую поверхность (тарелку, пластинку) наносят крупную каплю (0,1 мл) сыворотки крови реципиента и маленькую капельку (0,01 мл) крови донора из флакона и смешивают их между собой, периодически покачивая тарелку (пластинку). Реакция проводится при температуре 15 – 25⁰С, результаты оценивают через 5 минут: отсутствие агглютинации эритроцитов донора свидетельствует о совместимости крови донора и реципиента по системе АВО. Появление агглютинации указывает на их несовместимость – такую кровь данному больному переливать нельзя.

б) Проба на индивидуальную совместимость по резус-фактору

После того как установлена совместимость крови донора и реципиента по системе АВО, необходимо установить совместимость в отношении резус-фактора. Проба на совместимость по резус-фактору может быть проведена в одном из двух вариантов:

- проба с использованием 33% полиглюкина;

- проба с использованием 10% желатина.

В клинической практике наибольшее распространение получила проба с полиглюкином.

Проба с использованием 33% полиглюкина

Реакция проводится в центрифужной пробирке без подогрева в течение 5 минут. На дно пробирки вносят 2 капли сыворотки реципиента, 1 каплю донорской крови и 1 каплю 33% раствора полиглюкина. После этого содержимоее перемешивают, наклоняя пробирку и вращая ее вокруг оси, распределяя содержимое по стенкам ровным слоем. Пробирку вращают в течение 5 минут, после чего добавляют 3 – 4 мл физиологического раствора и аккуратно перемешивают, 2 – 3 раза наклоняя пробирку до горизонтальной плоскости (не взбалтывая!). После этого оценивают результат: наличие агглютинации эритроцитов свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента по резус-фактору, такую кровь переливать нельзя. Равномерное окрашивание содержимого в пробирке, отсутсвие реакции агглютинации указывает на совместимость крови донора и реципиента по резус-фактору.

Проба с использованием 10%желатина

На дно пробирки помещают 1 каплю эритроцитов донора, предварительно отмытых десятикратным объемом физиологического раствора, затем добавляют 2 капли подогретого до разжижения 10% раствора желатина и 2 капли сыворотки реципиента.

Содержимое пробирки перемешивают и помещают в водяную баню при температуре 46 – 48⁰ С на 10 минут. После этого в пробирку добавляют 6 – 8 мл физиологического раствора, перемешивают содержимое, переворачивая пробирку 1 – 2 раза, и оценивают результат: наличие агглютинации эритроцитов свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента, ее переливание недопустимо.

Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в ней не наблюдается реакция агглютинации, кровь донора совместима с кровью реципиента по резус-фактору.

Биологическая проба

Несмотря на определение совместимости крови донора и больного по системе АВО и резус-фактору, нельзя быть уверенным в полной их совместимости.

Существует большое количество второстепенных групповых систем, которые могут стать причиной развития осложнений. Для исключения этой возможности в начале гемотрансфузии проводится еще одна проба на совместимость – биологическая проба.

Вначале струйно переливают 10 – 15 мл крови, после чего трансфузию прекращают (перекрывают капельницу) и в течение 3 минут наблюдают за состояние больного. При отсутсвии клинических проявлений реакции или ослажнения (учашение пульса, дыхания, появление одышки, затрудненое дыхание, гиперемия лица и т.д.) водят вновь 10 – 15 мл крови и в течение 3 минут снова наблюдают за больным. Так повторяют трижды.

Отсутствие реакций у больного после трехкратной проверки является признаком совместимости вливаемой крови служит основанием для осуществления всей гемотрансфузии.

При несовместимости крови донора и реципиента во время биологической пробы поведение пациента становится беспокойным: появляются тахикардия, одышка, гиперемия лица, ощущение озноба или жара, стеснение в груди, боли в животе, и очень важный прзнак – боли в поясничной области.

При появлении этих признаков кровь считают несовместимой и гемотрасфузию не проводят.

 

Макроскопическая оценка годности крови

 

Сестра должна уметь определить по визуальным признакам, пригодна ли для переливания данная трансфузионная среда. Для этого производится визуальный контроль флакона или контейнера с кровью и ее компонентами.

При этом необходимо обратить внимание на следующие данные:

1) правильность паспортизации (наличие этикетки с номером, даты заготовки, обозначения группы и резус-принадлежности, наименование консерванта, фамилии и инициалов донора,, наименование учреждения-заготовителяя, подписи врача);

2) срок годности. Раньше при использовании в качестве консерванта глюгицира обозначали только дату заготовки крови, при этом кровь можно было переливать в течение 21 дня после этой даты. В настоящее время применение новых консервантов сделало возможным увелечение этого срока до 35 суток. Поэтому срок годности теперь обозначают на этикетке нарряду с датой заготовки;

3) герметичность упаковки. Упаковка должна быть абсолютно целостной. Никакие следы нарушения целостности не допустимы;

4) кровь должна быть разделена на три слоя: внизу красные эритроциты, выше – узкая серая полоска лейкоцитов и тромбоцитов, над ними – желтая прозрачная плазма;

5) плазма должна быть прозрачной, не содержать пленок и хлопьев, которые свидетельствуют об инфицированности крови, а также сгустков. Плазма может быть непрозрачной в случае так называемой хиллезной крови, т.е. крови, содержащей большое количество нейтральных жиров. При нагревании хиллезной крови до 37⁰С плазма становится прозрачной, если же кровь инфицирована – остается мутной.