Коагуляционная проба Вельтмана

Значение метода: Сыворотку крови можно представить как коллоидную систему, устойчивость которых зависит от содержания белковых фракций крови и соотношения между ними. Повышенной устойчивостью обладают альбумины – белки, с малыми размерами молекул, выраженным электрич. зарядом и высокой степенью гидратации. У глобулинов-большие размеры молекул сочетаются с меньшим зарядом и более низкой степенью гидратации. В связи с этими особенностями устойчивость глобулинов значительно ниже. Коллоидная устойчивость сыворотки крови уменьшается при снижении фракции альбуминов, при заболеваниях печени (гепатит, цирроз, острая желтая атрофия печени), при гемолитических состояниях. Также считают, что коагуляционная проба снижена при повышении содержания гамма-глобулинов, снижающих стабильность сыворотки. Увеличение пробы наблюдается при острых воспалительных и эксудативных процессах, когда увеличивается кол-во альфа- и бета- глобулинов, повышающих стабильность сыворотки.(эксудативная фаза ревматизма, активный процесс туберкулеза легких, злокачественных опухолей, больших потерях жидкости, острых инфекционных заболеваниях). В клинико-диагностических лабораториях широко используют методы при которых реакциями коагуляции обнаруживают изменения в составе белков сыворотки крови. Одним из таких методов является коагуляционная проба Вельтмана.

Принцип метода: Устойчивость р-ров высокомолекулярных соединений (белков) зависит от 2-х факторов: величины заряда молекул и степени их сольватации. В пробе Вельтмана для получения коагуляции белков сыворотки крови используется раствор СаСI2, который как электролит снижает заряд молекул и тепловую денатурацию, в результате которой молекулы белка приобретают гидрофобные свойства и теряют гидратную оболочку.

Ход работы: К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 4,9 мл дистил., воды, перемешивают и прибавляют 0,1 мл раствора СаСI2, встряхивают и нагревают на пламени до однократного

закипания. Охлаждают и на свету наблюдают за появлением коагуляции белка. Если белки не коагулировали, то добавляют еще 0,1 мл СаСI2 и вновь кипятят. Процедуру повторяют до тех

пор, пока не выпадут хлопья. Результаты оценивают, подсчитывая общее количество 0,5% раствора СаСI2 пошедшего на реакцию. В норме реакция наступает при добавлении 0,4- 0,5 мл СаСI2.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №18

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ГЕМОГЛОБИНА МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОЙ ДЕНАТУРАЦИИ

Значение метода: У детей при рождении количество гемоглобина выше, чем у взрослого (60-70%). Нв у новорожденного составляет фетальный гемоглобин и 30-40% Нв (взрослого типа). После рождения фетальный гемоглобин убывает и к 5-6 месяцам жизни составляет 1-2 % всего Нв. Фетальный Нв отличается от взрослого рядом свойств: он растворяется при более высоких концентрациях солей, более устойчив к щелочам, имеет другую электрофоретическую подвижность. Определение фетального гемоглобина имеет большое значение не только у детей, но и у взрослых при различных патологических состояниях, например при гипоксиях (пневмонии, инфаркте миокарде, гепатите, хроническом бронхите и др).

Принцип метода: Основан на большой устойчивости фетального Нв к щелочам.

Ход работы: В пробирку отмеряют 4,9 мл 0,04% р-ра NН4ОН и 0,1 гемолизата. Жидкость встряхивают 2-3 мин. Оптическую плотность определяют с зеленым светофильтром в кювете на 0,3 см против воды. Количество Нв определяют по калибровочному графику в г/л.

Норма = 130-185г/л.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №19

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА МЕТОДОМ ИЕНДРАШЕКА

Значение метода: Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия.

Пигменты	Желтухи
	Механическая	Острый гепатит	Гемолитическая
Свободный билирубин крови	Не изменен	Незначительно повышен	Резко повышен
Связанный билирубин крови	Резко повышен	Значительно повышен	Незначительно повышен
Билирубин мочи	Значительно повышен	Незначительно повышен	Не изменен
Уробилин мочи	Не изменен или снижен	Значительно повышен	Резко повышен
Стеркобилин кала	Снижен	Не изменен или снижен	Резко повышен
Органоспецифические ферменты	Умеренная гиперферментемия	Резкая гиперферментемия на ранних стадиях	Не изменены

 

Принцип метода: при добавлении кофеинового реактива к сыворотке весь билирубин переходит в диссоциированное состояние и дает розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом. Без добавления кофеинового реактива окрашивание с диазореактивом дает только холебилирубин. По интенсивности окраски определяют светопоглащение.

Ход работы:

Реактивы	Пробирка 1	Пробирка 2	Пробирка 3
	Общий билирубин	Холебилирубин	Контроль
Сыворотка крови	0,5мл	0,5мл	1,0 мл
Физ. раствор	-	1,75мл	0,5 мл
Кофеиновый реактив	1,75мл	-	3,5 мл
Диазосмесь 10 мл диазо 1 0,3 мл диазо 2	0,25мл	0,25мл

Для развития окраски общего билирубина пробу оставляют на 20 минут. Холебилирубин колориметрируют через 10-15 минут после добавления смеси. При более длительном стоянии в реакцию вступает гембилирубин. Обе пробирки колориметрируют против контроля в кюветах на 0,5 см с зеленым светофильтром. Количество гембилирубина определяют по разности общего и холебилирубина.

Норма: общий 4,2-20,5 мкМоль/л, холебилирубин 1,0-5,2мкМоль/л.

Гембилирубин 3,2-15,4 мкМоль/л.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №20

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ТИТРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУРЕКСИДА

Значение метода: Определение Са крови имеет большое значение (клиническое). Са определяют при рахите, при спазмофилии, при костных заболеваниях, при некоторых заболеваниях почек. При рахите также определяют коэффициент (Са/Р), в норме он равен 1,9-2 а при рахите увеличивается до 3 и более.

Принцип метода: мурексид образует с ионами Са в щелочной среде комплексное соединение, окрашенное в красно- фиолетовый или бледно-розовый цвет (в зависимости от концентрации). При титровании раствором более сильного комплексо-образователя трилона Б, этот комплекс разрушается, что приводит к изменению окраски, свойственной свободному мурексиду (бледно-сиреневой).

Ход работы: в стаканчик вносят 50 мл дистил. воды, 10 капель 9н р-ра NаОН и прибавляют несколько крупинок мурексида. Сразу появляется бледно-сиреневое окрашивание, обусловленное свободным мурексидом. Приблизительно половину раствора переливают в другой чистый стаканчик и эта часть служит эталоном окраски свободного мурексида. К оставшейся части р-ра добавляют 1мл сыворотки, что приводит к появлению бледно- розового окрашивания, обусловленного образованием кальциево-мурексидного комплекса. Раствор немедленно титруют трилоном Б до возращения прежней окраски индикатора. Конец титрования устанавливают путем сопоставления опытной и контрольных проб.

С тр.Б х V тр. Б 3,6мэкв/л Vтр Б

С Са= ----------------------------- = ---------------------

Vсыв 1мл

 

Vтр.Б- Обьем трилона Б, пошедший на титрование.

Норма: Са=4,5-6,0 мэкв/л

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №21

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ.

Значение метода: Гиперфосфатемия встречается при почечной недостаточности, гипопаратиреозе, акромегалии, при гипервитаминозе Д, костных заболеваниях, туберкулезе, диабете, кетозе, повышенной мышечной работе, при молочной диете. Гипофосфатемия наблюдается при гиперпаратиреозе, остеомаляции, пеллагре, длительном лечении инсулином и хлористым кальцием, при нарушении всасывания фосфатов, Д- авитаминозном рахите.

Принцип метода: Неорганический фосфор при взаимодействии с (NН4)2МоО4 образует фосфорно-молибденовую кислоту, которая восстанавливается аскорбиновой кислотой до синего фосфорно-молибденового комплекса. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации неорганического фосфора.

Ход работы: К 4мл. дист.воды прилить 1мл сыворотки и 5мл трихлоруксусной кислоты (ТХУ), через 10 минут фильтруют. К 5мл фильтрата добавляют 1мл (NН4)2МоО4 и 1,8мл дистил.воды,

0,2 мл аскорбиновой кислоты. Через 20 минут колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром относительно дист. воды. Количество неорганического фосфора определяют по калибровочной кривой. Норма: 1,8- 2,4 мэкв/л.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №22

Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи.