Под редакцией профессора В.И. Шарапова

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

(ГОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития России)

 

 

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра биологической химии

 

ПРАКТИКУМ

К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

Под редакцией профессора В.И. Шарапова

Учебное пособие для студентов 1-2 курсов лечебного, педиатрического, стоматологического факультетов

 

Новосибирск - 2011

 

 

Под редакцией профессора В.И.Шарапова

Практикум к лабораторным занятиям по биологической химии. – Новосибирск, НГМУ.- 2011.- 40с.

 

 

В настоящем учебном пособии представлены лабораторные работы, выполняемые на практических занятиях по дисциплине «биологическая химия».

Лабораторные работы приведены в соответствии с рабочими программами по биологической химии для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Учебное пособие может быть использовано студентами для подготовки к практическим занятиям, коллоквиумам и экзамену по биологической химии.

 

 

ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2

 

Лабораторная работа №1

Определение общего белка сыворотки крови по биуретовой реакции......................................................................стр1

Лабораторная работа №2

Определение активности псевдохолинэстеразы сыворотки крови...........................................................................стр2

Лабораторная работа №3

Определение трансаминазной активности сыворотки крови....................................................................................стр3

Лабораторная работа №4

Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови..........................................................................стр4

Лабораторная работа №5

Определение активности амилазы (диастазы) в моче амилокластическим способом............................................стр5

Лабораторная работа №6

Количественное определение глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом

(по окислению фенофталеина)............................................................................................................................................стр6

Лабораторная работа №7

Определение глюкозы о- толуидиновым методом..........................................................................................................стр6

Лабораторная работа №8

Качественная реакция на определения сахара в моче- реактив Ниландера...........................................................стр7

Лабораторная работа №9

Турбидиметрический метод определения бета-липопротеидов сыворотки крови

по Бурштеиу и Самаи.......................................................................................................................................................стр7

Лабораторная работа № 10

Реакция образования иодоформа (на ацетоновые тела)...............................................................................................стр8

Лабораторная работа №11

Определение содержания холестерина в сыворотке крови (метод Ильке)..............................................................стр8

Лабораторная работа №12

Количественное определение общей кислотности. Пирамидоновая проба на обнаружение крови в желудочном соке. Реакция Уффельмана на молочную кислоту..........................................................................................................стр9

Лабораторная работа №13

Определение активности ГГТП сыворотки крови.......................................................................................................стр10

Лабораторная работа №14

Количественное определение мочевины в сыворотке крови....................................................................................стр10

Лабораторная работа №15

Количественное определение витамина С в сыворотке крови...................................................................................стр11

Лабораторная работа №16

Определение содержания витамина С в моче.................................................................................................................стр11

Лабораторная работа №17

Коагуляционная проба Вельтмана.....................................................................................................................................стр12

Лабораторная работа №18

Определение общего гемоглобина методом щелочной денатурации..........................................................................стр12

Лабораторная работа №19

Определение билирубина методом Иедрашека..............................................................................................................стр13

Лабораторная работа №20

Определение кальция, фосфора в сыворотке крови титрометрическим методом

с применением мурексида...................................................................................................................................................стр14

Лабораторная работа №21

Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи...............................................стр14

Лабораторная работа №22

Определение белка слюны биуретовым методом.........................................................................................................стр15

 

Лабораторная работа № 1

Количественное определение активности амилазы слюны........................................................................................стр16

Лабораторная работа №2

Определение активности щелочной фосфатазы слюны...............................................................................................стр16

Лабораторная работа №3

Определение трансаминазной активности слюны......................................................................................................стр17

Лабораторная работа №4

Определение кальция в слюне титрометрическим методом с применением мурексида...................................стр18

 

ПРАВИЛА РАБОТЫ НА КФК-2

 

1.Калориметр включить в сеть за 15 мин. до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучек).

2. Установить необходимый светофильтр. При переключении светофильтров ручка «чувствительность» должна находится в положении «1» (красный светофильтр 670- «1», зеленый светофильтр 540- «1»), а ручка «установка 100 Грубо» в крайнем левом положении (это предохраняет прибор от перегрузки и порчи).

3. В световой поток поместить кювету с контрольным раствором по отношению к которому производят измерения.

4. Во вторую ячейку кюветодержателя поместить кювету с исследуемым раствором.

5. Закрыть крышку кюветного отделения.

6. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 вначале ГРУБО, затем ТОЧНО установить отсчет 100 по шкале калориметра.

7. Поворотом ручки под кюветным отделением до упора, ввести в световой поток кювету с исследуемым раствором.

8. Снять отсчет по шкале Д в единицах оптической плотности.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА СЫВОРОТКИ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Значение метода:

1) Нормопротеинемия 60-80г/л.

2) Гипопротеинемия:

1. Относительная (гидремия при нагрузке водой, водных отравлениях).

2. Абсолютная вследствие:

а) подавления синтеза белка (альбуминов при нарушении функции гепатоцитов, глобулинов при всех формах недостаточности РЭС).

б) потери белков преимущественно альбуминов (нарушение функции желудочно-кишечного тракта, нарушение почечного фильтра, кровоизлияния, увеличение проницаемости капилляров - отеки, обширные экссудаты, обширные выпоты в серозные полости);

в) усиление расхода альбуминов при голодании.

3) Гиперпротеинемия:

1. Относительная (обезвоживание)

2. Абсолютная вследствии усиления синтеза глобулинов (злокачественные новообразования, ряд форм лейкозов, инфекционное или токсическое раздражение РЭС).

 

Принцип метода: Биуретовый метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплексного соединения меди с пептидными группами белка. Характерная фиолетовая окраска раствора пропорциональна числу пептидных групп.

Ход определения: К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл биуретового реактива (состав: СuSO4, 5H2O, NaOH, сегнетова соль). Смешивают, избегая образования пены. В контрольную

пробу к 0,1мл физ.раствора добавляют 5мл биуретового реактива. Через 30 мин измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб на фотоэлектроколориметре. Зеленый светофильтр в кювете толщиной 1см против контроля. Окраска стабильная в течении 1 часа.

Расчет: Концентрацию белка в сыворотке крови определяют по калибровочному графику.

Норма 63-83 г/л.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2

Норма: АЛТ- 0,1-0,68 мкм/л.ч

АСТ- 0,1-0,45 мкм/л.ч

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПСЕВДОХОЛИНЭСТЕРАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ.

 

Значение метода: определение сывороточной псевдохолинэстеразы имеет важное значение, как метод функционального исследования печени. Этот фермент синтезируется в клетках печени и относится к группе секреторных ферментов. При нарушении белоксинтезирующей активности печени, содержание фермента в сыворотке крови сокращается.

Принцин метода: метод основан на фотометрическом определении концентрации уксусной кислоты, образованной при гидролизе ацетилхолинхлорида ацетилхолинэстеразой сыворотки крови.

Ход работы:

1 этап. В 2 пробирки (опыт и контроль) разливают 2,5 мл вероналового буфера с индикатором феноловым красным (рН 8,4) приливают 0,05 мл сыворотки крови и прогревают 5 минут в термостате при 37 градусах Цельсия.

2 этап. В обе пробирки приливают 0,1 мл (2-3 капли) ацетилхолинхлорида.

В контрольную пробу добавляют 2-3 капли прозерина (ингибитор фермента) и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

3 этап. После инкубации сразу же в опытную пробу добавляют 0,1мл (2-3 капли) прозерина, ингибитора фермента. Смесь охлаждают при комнатной температуре.

4 этап. Производят измерение оптической плотности опытной пробы против контроля на ФЭКе в кювете на 0,5 см при зеленом светофильтре. Окраска устойчива в течение часа.

Расчет: из показателя оптической плотности холостой пробы вычитают показатель оптической плотности опыта и по калибровочному графику находят активность фермента, которая выражается в микромолях уксусной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки крови в течении часа при 38 градусах Цельсия.

Норма: 160-340 мкМ./ час.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ.

Принцип метода: Под действием фермента сыворотки крови бета - глицерофосфат подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфата, по которому судят об активности данного фермента.

Ход определение: Тщательно сполостнуть дистиллированной водой пробирки и воронки.

 

РЕАКТИВЫ	ОПЫТ	КОНТРОЛЬ
1.Раствор бета-глицерофосфата	1мл	1мл
2. Сыворотка	0,1мл инкубация 30 мин при 37градусах	-
3. ТХУ-10%	1мл	1мл
4.СЫВОРОТКА	-	0,1 мл
Тщательно перемешать и фильтровать через смоченный дистиллированной водой фильтр. К фильтрату добавить:
5. Молибденовый раствор	1мл	1мл
6. Раствор аскорбиновой кислоты	1мл	1мл
Перемешать и через 10 мин. колометрировать контроль и опыт против Н20 (красный светофильтр, кюветы 5 мл).   РАСЧЕТ: Из коэффициента светопоглощения опыта (Е оп) вычесть коэффициент светопоглощения контроля (Е контр). Разность посмотреть по калибровочному графику. В норме активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови взрослых 1,0-6,0 мм/час л., у детей до 6лет 2,5-15 мм/час до 16 лет 5,0-30,0 мм/час л.

 

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В МОЧЕ АМИЛОКЛАСТИЧЕСКИМ СПОСОБОМ.

Значение метода: Диастаза (альфа-амилаза) является экскреторным ферментом. Наиболее богаты амилазой поджелудочная и слюнные железы. В норме активность этого фермента в крови сравнительно невелика в связи с тем, что амилаза-низкомолекулярный белок, она проходит через почечный фильтр и определяется в моче. Повышение амилазной активности мочи прежде всего связывается с повреждением клеток поджелудочной железы (увеличение проницаемости мембран, некротизированных клеток, нарушение оттока секрета в 12-перстную кишку). Так, при остром панкреатите амилазная активность мочи может увеличиться в 10-30 раз. Повышение амилазной активности мочи, но в меньшей степени, может сопровождать воспаление слюнных желез (острый паротит). Снижение активности амилазы в плазме крови наблюдается при уменьшении синтеза фермента при снижении функции поджелудочной железы, склерозировании органа.

Принцип метода: Основан на фотометрическом измерении падения концентрации крахмала в результате ферментативного гидролиза.

Ход работы:

РЕАКТИВЫ ОПЫТ КОНТРОЛЬ

1. Крахмал 2% 0,5 нагрев 0,5 нагрев

2.Фосфатный буфер 0,3 10 мин 0,3 10 мин

3. Nа СI 3% 0,1 при 37градусах 0,1 при 37 градусах

 

 

4.НСI (1Н) --- инкубировать 0,1 инкубировать

5.Моча 0,1 30 мин - 30 мин

6.Н20 при 37 градусах 0,1 при 37 градусах

 

Реакцию ОПЫТА прерывают прибавлением 0,1мл НСI

По 0,2 мл содержимого пробирок ОПЫТА и КОНТРОЛЯ переносится в разные колбы емкостью 50 мл. В каждую из колб прибавляют примерно по 40 мл воды, 0,5 НСI и 0,1 мл раствора йода и доливают до метки дистил. водой. Еоп и Е контр измеряют на ФЭКе при красном светофильтре с толщиной кюветы 1см, против воды. Амилазную активность мочи выражают через количество мг крахмала, гидролизованного амилазой, содержащей в 1мл мочи за 60 мин при 37 градусах.

Расчет

Е контр-Еоп * 10 * 20 *10

Хмг крахмала= ----------------------------

Еконтр

Где: Е-экстинкция или коэффициент

10-количество мг крахмала, введенного в опытную и контрольную пробы.

20-коэффициент перерасчета на 1мл биологической жидкости за час инкубации.

10-разведение мочи

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ О-ТОЛУИДИНОВЫМ МЕТОДОМ.

Принцип метода: Альдогексозы (глюкоза, галактоза, ксилоза) при нагревании с орто- толуидином в кислой среде дают синезеленое окрашивание, интенсивность которого определяется колометрически.

Ход работы: 0,2мл сыворотки крови (спинномозговой жидкости) вносят в пробирку с 2мл 6% ТХУ. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. К фильтрату приливают 2мл. О-толуидинового реактива и ставят на 8 минут в кипящую баню. После охлаждения (15 мин) фотометрируют при красном светофильтре. В качестве контроля используется вода. Параллельно определяют светопоглощение стандартного раствора глюкозы (0,05мл глюкозы) обработанного так же, как и опытная проба.

 

А

Расчет: ------ х 200 = мг %

Б х 4

 

А-светопоглошение образца

Б-светопоглощение раствора глюкозы (800 мг на 100мл)

Норма: кровь –70-110мг %, плазма-60-100мг %, спинномозговая жидкость-45-70мг %.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ (ПО ОКИСЛЕНИЮ ФЕНОЛФТАЛЕИНА).

Принцип метода:

В-d глюкоза + в-d глюкозооксидаза глюколактон + ФАДН2

-------------------------

ФАД

 

 

ФАДН2+О2 = ФАД +Н2О2

 

 

Норма: 3,5-5,7 ммоль/л.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8

КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРА В МОЧЕ - РЕАКТИВ НИЛАНДЕРА.

Реакция Ниландера относится к окислительно-восстановительным методам определения сахара. Она основана на окислении глюкозы солью висмута Вi (NO3)2 в щелочной среде. При кипячении, в случае наличия сахара в моче, выпадает черный осадок

металлического висмута.

 

O

|| 2+ ОН

R-C-H + Bi ----------------® R- COOH + Bi

t

 

 

Ход работы:

К 1-2 патологической мочи прибавляют 0,5-1мл реактива Ниландера и кипятят 2 мин.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №9

ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕТА- ЛИПОПРОТЕИДОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПО БУРШТЕЙНУ И САМАИ.

Значение метода: По изменению липопротеидов сыворотки можно судить о различных патологических процессах организма человека. Увеличение содержания бета-липопротеидов- наиболее часто встречающееся в липограмме отклонение от нормы. Оно отмечается при атеросклерозе, внутрипеченочном холестазе, механической желтухе, диабете, при резких гипопротеинемиях, гликогенозах, ксантоматозе и др. Увеличение бета-липопротеидов в крови тесно связано с гиперхолестеринемией, поскольку холестерин входит в состав, главным образом, бета-липопротеидов.

Принцип метода: Метод основан на избирательном осаждении бета-липопротеидов с помощью гепарина в присутствиии ионов Са. Введение гепарина в присутствии Са вызывает связывание бета-липопротеидов и помутнение раствора, оптическую плотность которого можно измерить на ФЭКе. Степень помутнения соответствует концентрации бета-липопротеидов.

Ход работы: К 2мл 0,025М р-ра СаСI2 добавляют 0,2 мл сыворотки крови и оптическую плотность р-ра определяют на ФЭКе (Е1) в кювете толщиной 0,5 см с красным светофильтром против воды. Затем в кювету добавляют 0,04мл 10% р-ра гепарина и содержимое перемешивают. Бета-липопротеиды образуют комплекс с гепарином, дающий помутнение р-ра. При этом оптическая плотность увеличивается (Е2). Определяют точно через 4мин после добавления гепарина. Разница Е1 – Е2 приходится на оптическую плотность, обусловленную липопротеидами. Количественную оценку проводят по калибровочному графику и выражают в мг%.

Норма 300-400мг% (3-6 г/л).

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №10

1. РЕАКЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ИОДОФОРМА (НА АЦЕТОНОВЫЕ ТЕЛА).

 

1мл. мочи + 1мл. NаОН + 5 капель I2 в КI = желтое окрашивание.

 

 

2. ПРОБА С ХЛОРНЫМ ЖЕЛЕЗОМ.

 

1мл. мочи + 5 капель хлорного железа = вишнево- красное окрашивание.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

(МЕТОД ИЛЬКЕ).

Значение метода: Холестерин может накапливаться в крови в больших количествах при нарушении жирового обмена. Длительная гиперхолестеринемия при измененных условиях растворимости холестерина приводит к развитию атеросклероза. Гиперхолестеринемия наблюдается при механической желтухе, нефрите и нефрозах, гипотериозе, авитаминозе группы «В». Очень высокое содержание холестерина в крови наблюдается при сахарном диабете, липоидном нефрозе. Гипохолестеринемия обнаружена при анемиях, лихорадочных состояниях, сыпном тифе, голодании, гипертиреозе, раковой кахексии, поражении ЦНС.

Принцип метода: Холестерин в присутствии смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и конц. серной кислоты в соотношении 1:5:1 (реактив Ильке) превращается в сульфокислоту холестерина зеленого цвета.

Ход работы: в сухую пробирку к 2 мл реактива Ильке добавить 0,1 мл сыворотки. Сыворотку вносить медленно по стенке пробирки. Затем встряхивают содержимое пробирки и помещают в темное место на 20 мин. Окрашенную в зеленный цвет жидкость колориметрируют на ФЭКе, применяя красный светофильтр в кювете 0,5см. Контроль при фотометрировании - реактив Ильке. Содержание холестерина определяется по калибровочному графику.

В норме содержание холестерина 3,5-6,8 мМоль или 116-242 мг %

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №12

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ КИСЛОТНОСТИ, ОБЩЕЙ СОЛЯНОЙ КИСЛОТЫ, СВОБОДНОЙ СОЛЯНОЙ КИСЛОТЫ В ОДНОЙ ПОРЦИИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА.

Значение метода: При клиническом анализе желудочного содержимого важнейшее значение имеет содержание кислот. Повышенная кислотность может указывать на язвенную болезнь и (или) 12-перстной кишки, гиперацидный гастрит. Пониженная кислотность встречается при ряде желудочно-кишечных заболеваний (гипоацидный гастрит), раке желудка. Кислоты желудочного сока, всасываясь в кровь, играют большую роль в кислотно-щелочном равновесии организма.

Принцип метода: Определение общей кислотности, свободной и связаной соляной кислоты проводят титрованием желудочного содержимого щелочью, с применением индикатора, которые в зависимости от рН среды меняют окраску, индикатор фенолфталеин (индикатор на общую кислотность) в кислой среде остается бесцветным, а в щелочной окрашивается в розовый цвет. Индикатор диметиламиноазобензол в присутствии свободной НСI окрашивается в ярко-красный цвет, в ее отсутствии дает желтое или оранжевое окрашивание. Зона перехода фенолфталеина лежит в пределах рН 8,2-10, а диметиламиноазобензола рН 2,9-4,0.

Ход работы: Отмеривают пипеткой в колбочку 10 мл. Профильтрованного желудочного сока и добавляют 1-2 капли диметиламиноазобензола и 2 капли фенолфталеина. Титруют 0,1Н раствором NаОН до цвета красной рыбы, т.е желтовато-красной окраски. Первая точка. Затем продолжают тирование до лимонножелтого цвета. Вторая точка. И, наконец, до розового окрашивания. Т ретья точка.

Расчет:

Свободная НСI = Количество NаОН в 1 точке умноженное на 10.

Общая НСI= Количество NаОН во 2 точке + Количество NаОН в 3 точке: 2 * 10

 

Связанная НСI= Общая НСI- Свободная НСI

Общая кислотность= Количество NаОН в 3 точке умноженное на 10.

Норма

Общая кислотность желудочного сока 40-60Ед

Свободная НСI-20-40 Ед

Кислотность желудочного содержимого выражается в титрационных единицах – количестве 0,1 р-ра NаОН, пошедших на титрование 100мл желудочного сока.

(для опыта взято 10мл желудочного сока, поэтому умножают на 10).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №13

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №14

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №15

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода: количественного определения витамина С в сыворотки крови основан на его способности восстанавливать 2,6- дихлорфенолиндофенол, который в щелочной среде имеет синюю окраску, а в кислой красную.

Ход работы: К 5 мл сыворотки крови добавляют равный объем 20% сульфосалициловой кислоты для осаждения белков. Выпавший в осадок белок отфильтровывают, 6 мл фильтрата наливают в колбу для титрования (это будет соответствовать 3 мл сыворотки крови) и титруют из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 секунд. Подсчитывать содержание витамина С в крови по формуле:

 

г эквив. витамина С х А х 100

Х= _________________________________ =мг %

 

В

 

Где: Х- содержание витамина С в крови

Г - эквив. Витамина С-граммэквивалент вит С =88

Н - нормальность р-ра 2,6-дихлорфенолиндофенола =0,001

А - количество мл 2,6-дихлофенолиндофенола, пошедшего на титрование.

В - количество мл сыворотки, взятой в опыт (3мл)

100-коэфициент для пересчета в мг%

 

Норма: 0,8-1,2 мг%.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №16

Норма: 10-20 мг/сутки.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №17

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №18

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №19

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №20

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ТИТРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ С ПРИМЕНЕНИЕМ МУРЕКСИДА

Значение метода: Определение Са крови имеет большое значение (клиническое). Са определяют при рахите, при спазмофилии, при костных заболеваниях, при некоторых заболеваниях почек. При рахите также определяют коэффициент (Са/Р), в норме он равен 1,9-2 а при рахите увеличивается до 3 и более.

Принцип метода: мурексид образует с ионами Са в щелочной среде комплексное соединение, окрашенное в красно- фиолетовый или бледно-розовый цвет (в зависимости от концентрации). При титровании раствором более сильного комплексо-образователя трилона Б, этот комплекс разрушается, что приводит к изменению окраски, свойственной свободному мурексиду (бледно-сиреневой).

Ход работы: в стаканчик вносят 50 мл дистил. воды, 10 капель 9н р-ра NаОН и прибавляют несколько крупинок мурексида. Сразу появляется бледно-сиреневое окрашивание, обусловленное свободным мурексидом. Приблизительно половину раствора переливают в другой чистый стаканчик и эта часть служит эталоном окраски свободного мурексида. К оставшейся части р-ра добавляют 1мл сыворотки, что приводит к появлению бледно- розового окрашивания, обусловленного образованием кальциево-мурексидного комплекса. Раствор немедленно титруют трилоном Б до возращения прежней окраски индикатора. Конец титрования устанавливают путем сопоставления опытной и контрольных проб.

С тр.Б х V тр. Б 3,6мэкв/л Vтр Б

С Са= ----------------------------- = ---------------------

Vсыв 1мл

 

Vтр.Б- Обьем трилона Б, пошедший на титрование.

Норма: Са=4,5-6,0 мэкв/л

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №21

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ.

Значение метода: Гиперфосфатемия встречается при почечной недостаточности, гипопаратиреозе, акромегалии, при гипервитаминозе Д, костных заболеваниях, туберкулезе, диабете, кетозе, повышенной мышечной работе, при молочной диете. Гипофосфатемия наблюдается при гиперпаратиреозе, остеомаляции, пеллагре, длительном лечении инсулином и хлористым кальцием, при нарушении всасывания фосфатов, Д- авитаминозном рахите.

Принцип метода: Неорганический фосфор при взаимодействии с (NН4)2МоО4 образует фосфорно-молибденовую кислоту, которая восстанавливается аскорбиновой кислотой до синего фосфорно-молибденового комплекса. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации неорганического фосфора.

Ход работы: К 4мл. дист.воды прилить 1мл сыворотки и 5мл трихлоруксусной кислоты (ТХУ), через 10 минут фильтруют. К 5мл фильтрата добавляют 1мл (NН4)2МоО4 и 1,8мл дистил.воды,

0,2 мл аскорбиновой кислоты. Через 20 минут колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром относительно дист. воды. Количество неорганического фосфора определяют по калибровочной кривой. Норма: 1,8- 2,4 мэкв/л.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №22

Качественные реакции на неорганические и органические составные части мочи.

 

Химическое обнаружение крови в моче сводится к нахождению кровяного пигмента гемоглобина. Гемоглобин обладает пероксидазной активностью и способен окислять пирамидон в присутствии перекиси водорода. При этом получается окрашенный продукт реакции, фиолетовый.

Ход определения: К 0,5мл спиртового р-ра пирамидона прибавляют 5 капель конц. уксусной кислоты, 0,5 мл 3% Н2О2 и 1мл мочи. При положительной пробе получается фиолетовая окраска.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЦЕТОНОВЫХ ТЕЛ

Проба с хлорным железом: 1мл мочи + 5капель хлорного железа =вишнево-красное окрашивание.

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРА- РЕАКЦИЯ НИЛАНДЕРА.

Реакция Ниландера относится к окислительно-восстановительным методам определения сахара. Она основана на окислении глюкозы солью висмута Вi(NО3)2 в щелочной среде.

R- COH + Bi ------------- R-COOH +Bi

ОН

При кипячении, в случае наличия сахара в моче, выпадает черный осадок металлического висмута.

Ход работы: к 1-2мл патолог. мочи прибавляют 0,5мл реактива Ниландера и кипятят 2 мин.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА СЛЮНЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ.

Принцип метода: белки в щелочной среде реагируют с сернокислой медью с образованием комплексных соединений, окрашенных в фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации белка в растворе.

Ход определения:

1.Тщательно прополоскать рот водой;

2.Отмерить в стаканчик 20 мл дистиллированной воды, прополоскать рот и выплюнуть содержимое в тот же стаканчик;

3.Впробирку отмерить 3,0 мл разведенной слюны (из стаканчика), добавить 3,0 мл биуретового реактива и через 30 минут колориметрировать на ФЭКе против контроля (зеленый светофильтр).

Приготовление контроля: 3,0 мл физ. раствора + 3мл биуретового реактива.

Время экспозиции 30 мин.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФОТА ЗЫ СЛЮНЫ.

Принцип: Под действием фермента слюны бета-глицерофосфат натрия подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфата, по которому судят об активности данного фермента.

Ход определения:

РЕАКТИВЫ ОПЫТ КОНТРОЛЬ

1. р-р в-глицерофосфата 1мл 1мл

2. слюна 0,2 мл --

Инкубация 30 мин при 37 градусах Цельсия.

3. ТХУ 10% 1мл 1мл

4. слюна -- 0,2мл

Тщательно перемешивают и фильтруют через смоченный дистиллированной водой фильтр.

К фильтрату добавить:

5. молибденовый р-р 1мл 1мл

6. р-р аскорбиновой

кислоты 1% 1мл 1мл

 

Через 10 минут колометрировать против воды (красный светофильтр, кюветы 5мм).

Расчет: Из коэффициента светопоглощения опыта (Еоп) высчитают коэффициент светопоглащения контроля (Е контр). Разность посмотреть по калибровочному графику. Результат выражен в условных единицах.

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4

Норма: АЛТ- 0,1-0,68 мкм/л.ч

АСТ- 0,1-0,45 мкм/л.ч

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В СЛЮНЕ ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫМ МЕТОДОМ (ПО ОКИСЛЕНИЮ ФЕНОЛФТАЛЕИНА)

Принцип метода:

 

В-d глюкоза + в-d глюкозооксидаза глюколактон + ФАДН2

-------------------------

ФАД

 

 

ФАДН2+О2 = ФАД +Н2О2

 

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6

Глюкоза

Универсальный источник энергии для клеток - главное вещество, из которого любая клетка человеческого организма получает энергию для жизни. Потребность организма в энергии, а значит - в глюкозе - увеличивается параллельно физической и психологической нагрузке под действием гормона стресса - адреналина, во время роста, развития, выздоровления (гормоны роста, щитовидной железы, надпочечников). Для усвоения глюкозы клетками необходимо нормальное содержание инсулина - гормона поджелудочной железы. При его недостатке (сахарный диабет) глюкоза не может пройти в клетки, ее уровень в крови повышен, а клетки голодают.

Повышение (гипергликемия):

- сахарный диабет (недостаточность инсулина)

- физическая или эмоциональная нагрузка (выброс адреналина)

- тиреотоксикоз (повышение функции щитовидной железы)

- феохромоцитома (опухоль надпочечников, выделяющая адреналин)

- акромегалия, гигантизм (повышение уровня гормона роста)

- синдром Кушинга (повышение уровня гормона надпочечников - кортизола)

- заболевания поджелудочной железы (панкреатит, опухоль, муковисцидоз)

- хронические заболевания печени, почек

Снижение (гипогликемия):

- голодание

- передозировка инсулина

- заболевания поджелудочной железы (опухоль из клеток, синтезирующих инсулин)

- опухоли (избыточное потребление глюкозы как энергетического материала опухолевыми клетками)

- недостаточность функции эндокринных желез (надпочечников, щитовидной, гипофиза (гормон роста)

- тяжелые отравления с поражением печени (алкоголем, мышьяком, соединениями хлора, фосфора, салицилатами, антигистаминами)

- состояние после гастрэктомии, заболевания желудка и кишечника (нарушение всасывания)

- врожденная недостаточность у детей (галактоземия, синдром Гирке)

- у детей, рожденных от матерей с сахарным диабетом

- недоношенность

 

Общий белок

Белки - главный биохимический критерий жизни. Они входят в состав всех анатомических структур (мышцы, клеточные мембраны), переносят вещества по крови и в клетки, ускоряют течение биохимических реакций в организме, распознают вещества - свои или чужие и защищают от чужих, регулируют обмен веществ, удерживают жидкость в кровеносных сосудах и не дают ей уходить в ткани. Белки синтезируются в печени из аминокислот пищи. Общий белок крови состоит из двух фракций: альбумины и глобулины.

Повышение (гиперпротеинемия):

- обезвоживание (ожоги, диарея, рвота - относительное повышение концентрации белка за счет снижения объема жидкости)

- миеломная болезнь (избыточная продукция гамма-глобулинов)

Снижение (гипопротеинемия):

- голодание (полное или белковое - строгое вегетарианство, нервная анорексия)

- заболевания кишечника (нарушение всасывания)

- нефротический синдром (потеря в почках)

- повышенное потребление (кровопотеря, ожоги, опухоли, асцит, хроническое и острое воспаление)

- хроническая печеночная недостаточность (гепатит, цирроз)

 

Альбумин

Одна из двух фракций общего белка. Выполняет транспортную функцию.

Повышение (гиперальбуминемия):

Истинной (абсолютной) гиперальбуминемии не бывает. Относительная возникает при снижении общего объема жидкости (обезвоживании) - см. гиперпротеинемия.

Снижение (гипоальбуминемия):

Те же, что и для общей гипопротеинемии.

 

Билирубин общий (норма

Компонент желчи, состоит из двух фракций - непрямого (несвязанного), образующегося при распаде клеток крови (эритроцитов), и прямого (связанного), образующегося из непрямого в печени и выводящегося через желчные протоки в кишечник. Является красящим веществом (пигментом), поэтому при его повышении в крови изменяется окраска кожи - желтуха.

Повышение (гипербилирубинемия):

- избыточное разрушение эритроцитов (гемолитическая желтуха: резус-конфликт, переливание крови, гемолитическая анемия, малярия, физиологическая желтуха новорожденных)

- повреждение печеночных клеток (гепатиты, гепатозы - паренхиматозная желтуха)

- непроходимость желчных протоков (механическая желтуха)

- врожденные особенности обмена веществ (синдром Жильбера, семейная гипербилирубинемия)

 

Билирубин прямой

Одна из двух фракций общего билирубина (см). Определяют для дифференциальной диагностики гипербилирубинемии (желтухи).

Повышение:

- гемолиз эритроцитов

 

Мочевина

Продукт обмена белков, удаляющийся почками. Часть остается в крови.

Повышение:

- нарушение функции почек

- непроходимость мочевыводящих путей

- повышенное содержание белка в пище

- повышенное разрушение белка (ожоги, острый инфаркт миокарда)

Снижение:

- белковое голодание

- избыточное потребление белка (беременность, акромегалия)

- нарушение всасывания

 

Креатинин

Креатинин - как и мочевина, продукт обмена белков, выводящийся почками. В отличие от мочевины зависит не только от уровня белка, но от интенсивности его обмена. т.о. при акромегалии и гигантизме (повышенный синтез белка) его уровень растет, в отличие от уровня мочевины. В остальном причины изменения уровня те же, что для мочевины (см).

 

Мочевая кислота

Мочевая кислота – продукт обмена нуклеиновых кислот, выводящийся из организма почками.

Повышение (гиперурикемия):

- подагра (нарушение обмена нуклеиновых кислот)

- почечная недостаточность

- миеломная болезнь