Влияние ингибиторов на кинетику ферментативных реакций

Вещества, присутствие которых в системе понижает активность фермента, то есть уменьшает скорость реакции, называются ингибиторами.

Эффект ингибирования может происходить по разным причинам.

1. Ингибитор I конкурирует с субстратом за активный центр, так как по строению близок к нему и является псевдосупстратом, образуя с ферментом неактивный комплекс:

Е + I=ЕI.

Константа диссоциации комплекса ЕI называется константой ингибирования:

.

Начальная скорость реакции в присутствии ингибитора всегда меньше, чем в его отсутствие.

Если при увеличении концентрации субстрата в растворе активность фермента восстанавливается, такое ингибирование называется конкурентным.

Предельное значение скорости не зависит от присутствия ингибитора:

. (5.50)

Уравнение Михаэлиса – Ментена в присутствии ингибитора в этом случае имеет вид:

, (5.51)

где

, (5.52)

эффективная константа, зависящая от и .

Если и , то скорость реакции ингибирования будет равна .

Выражение для константы ингибирования выразим из (5.52):

. (5.53)

Таким образом, для определения К _I, кроме ,необходимо знать эффективную константу реакции в присутствии ингибитора и константу Михаэлиса в его отсутствие. и можно найти, решая задачу графическим методом, например в координатах Лайнуивера – Берга () для случая процесса с ингибитором и без ингибитора. Константу ингибирования можно рассчитать по уравнению (5.53) или определить непосредственно из графика, так как отношение тангенсов угла наклона прямых в точке пересечения с осью ординат равно .

2. Ингибитор не конкурирует с субстратом за активный центр, так как присоединяется к другой части молекулы белка с образованием неактивных комплексов (EI и ESI), имеющих константы равновесия:

(5.54)

Наличие ингибитора в этом случае приводит к снижению активности фермента, но не изменяет его сродство к субстрату.

Если достигается обратимость ингибирования, то есть восстановление активности фермента под действием отличных от субстрата веществ, такое ингибирование называется неконкурентным.

Если оба комплекса (EI и ESI) неактивны, то есть не дают продукта, а константы их диссоциации близки между собой (), то это равносильно дополнительному условию: ингибитор не мешает взаимодействию субстрата с ферментом, но уменьшает скорость реакции из-за неактивности образующихся комплексов на поверхности фермента.

В этом случае константа Михаэлиса остается постоянной величиной, а изменяется максимальная скорость процесса:

(5.55)

Уравнение Михаэлиса – Ментена в этом случае запишется как

. (5.56)

Если и , то скорость реакции ингибирования будет равна .

Выражение для константы ингибирования получим из (5.55):

. (5.57)

Линеаризация уравнения (5.56) и обработка экспериментальных данных для неконкурентного ингибирования в координатах позволяет определить и зная .

3. При бесконкурентном ингибировании образуется один не активированный комплекс (ESI) с константой равновесия

. (5.58)

Уравнение Михаэлиса – Ментена в этом случае запишется как

, (5.59)

где

. (5.60)

В этом случае эффективная константа отличается от значения для конкурентного ингибирования, но эффективная скорость выражается уравнением, аналогичным для не конкурентного ингибирования.

Линеаризация уравнения (5.59) и обработка экспериментальных данных для неконкурентного ингибирования в координатах позволяет определить постоянные и зная c _I⁰.

 

Примеры решения задач.

Пример 1.

Рассчитайте значение константы Михаэлиса и значение максимальной скорости ( и ) всеми возможными методами для реакции гидролиза метилового эфира N-бензоил-L-аминомасляной, катализируемого α-химотрипсином. Известны данные о зависимости начальной скорости от концентрации субстрата:

·10^3, М	·10^7, моль/с
2.24	4,25
2.24	4,31
1, 49	3,52
1, 49	3,60
1, 12	3,10
1, 12	3,12
0,90	2,71
0,90	2,77
0,75	2,45
0,75	2,40

 

Решение.

Для графического решения преобразуем уравнение Михаэлиса – Ментена в линейную форму.

1. Способ Лайнуивера – Берка.

Уравнение приводится к виду:

Рассчитанные значения , заносим в таблицу и строим график в соответствующих координатах.

∙10^–2, М^–1	4,46	4,46	6,71	6,71	8,93	8,93	11,11	11,11	13,33	13,33
∙10^–6, с/моль	2,35	2,32	2,84	2,78	3,23	3,21	3,69	3,61	4,08	4,17

 

 

Отрезок на оси ординат получается равным 1/ v _max = 1,45∙10⁶, поэтому

v _max = 1 / (1,45∙10⁶) = 6,9∙10^–7 моль/с.

Тангенс угла наклона прямой равен tg α = 2000, следовательно

K_М = tg α ∙ v _max = 2000 ∙ 6,9∙10^–7 = 1,38∙10^–3 М.

 

2. Второй способ Лайнуивера – Берка

Строят график по уравнению

в координатах ,

∙10^3, М	2,24	2,24	1,49	1,49	1,12	1,12	0,90	0,90	0,75	0,75
∙10^–3, с/моль	5,27	5,20	4,23	4,14	3,61	3,59	3,32	3,25	3,06	3,13

 

Из графика получается, что прямая отсекает на оси ординат отрезок, равный = 2∙10³, а на оси абсцисс отрезок, равный – К_М = – 1,38∙10^–3. Поэтому К_М = 1,38∙10^–3 М, w_max = 1,38∙10^–3/(2∙10³) = 6,9∙10^–7 моль/с.

 

3. Способ Эдди–Хофсти.

Уравнение приводится к виду

Строится график в координатах v ₀, .

∙10^4, л/с	1,90	1,92	2,36	2,42	2,77	2,79	3,01	3,08	3,27	3,20
w0∙10^–7, с/моль	4,25	4,31	3,52	3,60	3,10	3,12	2,71	2,77	2,45	2,40

 

График даёт прямую линию, тангенс угла которой равен –1,36∙10^–3, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 6,86∙10^–3.

Поэтому. К_М = 1,36∙10^–3 М, v _max = 6,86∙10^–3 моль/с.
Пример 2.

Бензоат 1,2,5-триметилпиперидола-4 (β-изомер) ингибирует гидролиз бутирилхолина, катализируемый холинэстеразой. Определите тип ингибирования и рассчитайте константу диссоциации комплекса фермент–ингибитор. Экспериментальные данные:

·10^5, М	·10^4, М	·услов. Ед
	10.00 2,50 0,91 0,50	5,55 4,45 2,94 2,09
0,5	10.00 2,50 0,91 0,50	4,77 3,78 2,56 1,79
1,0	10.00 2,50 0,91 0,50	4,00 3,18 2,16 1,49
2,0	10.00 2,50 0,91 0,50	2,86 2,28 1,52 1,06
3,0	10.00 2,50 0,91 0,50	2,38 1, 58 1,24 0,87

Решение /

Рассчитаем константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции для различных концентраций ингибитора по способу Эдди–Хофсти. Так как неизвестен способ ингибирования, то используем эффективные значения константы Михаэлиса и максимальной скорости Уравнение Михаэлиса–Ментена приведём к виду (по способу Эдди–Хофсти)

Построим графики зависимостей в координатах (v, ) для разных значений концентрации ингибитора.

Для :

∙10^–4, усл.ед./М	0,56	1,78	3,23	4,18
v 0, усл.ед.	5,55	4,45	2,94	2,09

Уравнение прямой имеет вид , поэтому получаем v _max = 6.11 у.е., K_M = 0,97∙10^–4 М.

Для М:

∙10^–4, усл.ед./М	0,48	1,51	2,81	3,58
v 0, усл.ед.	4,77	3,78	2,56	1,79

 

Уравнение прямой =>

v _{max эф}. = 5,23 у.е., K _{M эф} = 0,96∙10^–4 М.

Для М:

∙10^–4, усл.ед./М	0,40	1,27	2,37	2,98
v 0, усл.ед.	4,00	3,18	2,16	1,49

 

Уравнение прямой =>

v _{max эф} = 4,40 у.е., K _{M эф} = 0,96∙10^–4 М.

Для М:

∙10^–4, усл.ед./М	0,29	0,91	0,67	2,12
v 0, усл.ед.	2,86	2,28	1,52	1,06

 

Уравнение прямой =>

v _{max эф} = 3,16 у.е., K _{M эф} = 0,98∙10^–4 М.

Для М:

∙10^–4, усл.ед./М	0,24	0,63	1,36	1,74
v 0, усл.ед.	2,38	1,58	1,24	0,87

 

Уравнение прямой =>

v _{max эф} = 2,41 у.е., K _{M эф} = 0,90∙10^–4 М.

 

Как видно из полученных значений, константа Михаэлиса остаётся неизменной, а максимальная скорость меняется. На этом основании можно сделать вывод, что ингибирование неконкурентное.

Рассчитываем константу ингибирования для М по уравнению

М.

 

Вопросы для самоконтроля

1. Какие соединения получили название «ферменты»? Какова их природа?

2. Перечислите основные классы, на которые разделяются ферменты. Почему их классифицируют не по типу химического строения?

3. Какие вещества называются ингибиторами? Какие различают типы ингибиторов?

4. В каком случае ингибитор называется конкурентным? Укажите схематически механизм этого процесса.

5. Какие три графических способа существуют для определения постоянных ?

6. Покажите как на основании опытных данных в отсутствие и в присутствии ингибитора определить константы: ?

Гетерогенный катализ

Первой наблюдаемой гетерогенно – каталитической реакцией была реакция, осуществленная в 1778 г. Пристли дегидратация этилового спирта на активной глине:

.

Металлические катализаторы были впервые применены Ван – Марумом

(1796 г.) в реакциях дегидрирования этилового спирта на меди, железе, никеле и серебре:

C₂H₅OH ® CH₃CHO + H₂.

В первой половине XXI века гетерогенному катализу было посвящено большое количество работ. Были открыты окислительные реакции в газовой фазе на металлах (Дэви), разложение аммиака и перекиси водорода (Тенар), гидрирование этилена на платине (Кюльман) и многие другие каталитические процессы. Дальнейшее развитие учения о катализе шло как по пути накопления экспериментальных данных, разработки способов приготовления активных катализаторов, открытия новых каталитических процессов, внедрения их в химическую промышленность, так и по пути развития теории гетерогенного катализа.

Но при этом теория развивалась значительно медленней практики, что объясняется отсутствием теории твердого тела. Так как процесс идет по поверхности твердого катализатора, знание строения поверхности катализатора и закономерностей адсорбционных явлений оказывается решающим для развития теории катализа.

В настоящее время гетерогенно-каталитические процессы широко применяются в промышленном производстве важнейших химических веществ. В качестве катализаторов применяются переходные металлы, металлы I группы, оксиды, сульфиды, различные группы комплексных соединений и др. Гетерогенно-каталитические процессы более распространены в промышленности, чем процессы гомогенного катализа. Это объясняется тем, что гетерогенные катализаторы более удобны в производстве, их легче отделить от газовой или жидкой среды в непрерывно действующих реакторах.