Иммунофлюоресцентная микроскопия

Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют АТ, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию.

Выделение грибов

Культуральные условия и потребности роста у патогенных грибов отличаются от таковых у возбудителей бактериальных инфекций. Большинство патогенных грибов не требовательно к питательным средам и хорошо растёт в аэробных условиях. Для роста грибов среды могут включать какой-либо органический источник углерода, неорганического азота в виде нитратов или аммонийных солей. рН питательных сред кислый (около 4,0–6,5), большинство бактерий не способно расти в подобных условиях. Среди витаминов большинство грибов нуждается в водорастворимых (например, биотине, рибофлавине, тиамине и др.). Большинство патогенных видов мезофилы и растёт в интервале температур 20–45 °С. При выделении обычно делают парные посевы, один из которых инкубируют при 25 °C, а второй — при 37 °C; подобная манипуляция позволяет выявить возможный диморфизм. Идентификацию возбудителя проводят по морфологическим и биохимическим признакам. В практической работе обычно используют два типа сред — неселективные и селективные.

Неселективные среды

Наиболее распространён агар СабурЏ — пептонный агар с мальтозой (или глюкозой). Его отличает высокое содержание углеводов, ингибирующее размножение бактерий. Также используют МПА, картофельно - декстрозный агар, агар ЧЊпека – ДЏкса, дрожжевой агар, сусло - агар и др. Нередко среды модифицируют добавлением антибиотиков, циклогексимида или хлоргексидина. Для выделения прихотливых патогенов (например Blastomyces dermatitidis и Histoplasma capsulatum) в качестве обогащённых сред применяют 5–10% КА, дополненный сердечным и мозговым экстрактом, либо асцитический агар. После образования колоний следует делать пересев на более простые среды, например картофельно-декстрозный агар или среду СабурЏ, на которых можно быстрее выявить споруляцию возбудителей.

Селективные среды

Селективные среды обычно получают на основе неселективных, с добавлением пенициллина (20 ЕД/мл), стрептомицина (40 ЕД/мл) или гентамицина (0,5 мкг/мл), левомицетина (16 мкг/мл). Для ингибирования бурного роста плесеней, подавляющих медленно растущие диморфные грибы, в среды вносят циклогексимид (0,5 мкг/мл). Следует помнить, что препарат подавляет рост некоторых патогенных грибов (например, Cryptococcus neoformans и Aspergillus fumigatus).

Выявление противогрибковых АТ и грибковых Аг

Наиболее часто применяют реакцию латекс-агглютинации (выявляет IgM), РСК (выявляет IgG) и ИФА. Результаты реакций часто могут быть сомнительными вследствие перекрёстного реагирования с Аг различных грибов. Тем не менее, идентификация АТ или циркулирующих Аг в крови, СМЖ и моче позволяет установить диагноз до получения результатов посевов.

Кожные пробы ранее были одним из популярных методов диагностики микозов, однако их неспецифичность ограничивает диагностическую ценность. В настоящее время их чаще используют для изучения иммунной прослойки в популяции при эпидемиологических исследованиях.

Гибридизация нуклеиновых кислот — новый метод идентификации патогенных грибов, разработанный для определения основных возбудителей системных микозов — бласто-, крипто- и кокцидиоидомикозов, а также гистоплазмоза. Для постановки реакции проводят экстракцию РНК из культуры и вносят одноцепочечные молекулы ДНК, меченные флюоресцеином. При наличии в культуре одного из четырёх указанных возбудителей происходит гибридизация соответствующей ДНК с РНК патогена с образованием легко обнаруживаемого комплекса. Основное достоинство метода — возможность применения на ранних сроках (5 сут) в культурах, содержащих мицелиальные и дрожжевые формы.

Методы обнаружения простейших

Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенностей возбудителя и в значительной степени зависит от правильного взятия клинического материала и адекватной фиксации. Ошибки при проведении этих мероприятий могут привести к получению ошибочных результатов.

Микроскопия

Поиск патогенных простейших обычно проводят в субстратах, являющихся средой их обитания — испражнениях, крови.

Испражнения

Для адекватного выявления паразитов в ЖКТ необходимо исследовать не менее трёх проб, полученных в течение 10 сут. Для диагностики амебиаза этого может оказаться недостаточным, и при подозрении на это заболевание необходимо исследовать шесть проб, полученных в течение 14 сут. Следует избегать попадания в материал воды или мочи, губительно действующих на простейших. Если больному в диагностических целях вводили внутрь сульфат бария, минеральное масло, препараты висмута или проводили специфическую терапию, то забор испражнений следует проводить не ранее 8-х суток после последнего введения. Для выявления трофозоитов (подвижных форм) жидкие испражнения необходимо исследовать в течение 30 мин после получения; при более оформленном стуле эти исследования можно провести в течение часа; на более поздних сроках трофозоиты обычно разрушаются. При невозможности своевременного обследования в образцы вносят фиксирующие растворы, сохраняющие морфологию взрослых особей.

Макроскопическое исследование может выявить примесь крови и слизи (частый диагностический признак амебиаза). Выявление же самих паразитов проводят при светооптической микроскопии влажных нативных препаратов либо в окрашеных мазках.

Микроскопия нативных препаратов. Небольшое количество испражнений наносят на предметное стекло, диспергируют в капле физиологического раствора, накладывают покровное стекло и исследуют под микроскопом на наличие трофозоитов (в жидкие испражнения физиологический раствор не вносят). Нативные препараты можно слегка докрашивать раствором ЛюгЏля, что облегчает выявление цист. Особенно внимательно необходимо исследовать кровь и слизь; желательно готовить отдельные препараты, не контаминированные (по возможности) фекальными массами.

Методы накопления. Для выявления паразитов, присутствующих в незначительных количествах, применяют различные методы накопления. При исследовании кала наиболее часто используют седиментационный метод. Для исследования забирают каплю надосадочной жидкости, наносят на предметное стекло, где смешивают с равным объёмом физиологического раствора, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Смесь на предметном стекле можно подкрашивать раствором Люголя, раствор разрушает трофозоиты, но позволяет хорошо визуализировать ядра и включения гликогена в цистах.

Микроскопия окрашеных мазков позволяет не только выявлять, но и дифференцировать простейших; окраску наиболее часто проводят гематоксилин-эозином по ХайденхЊйну.

Кровь

Капиллярную или венозную кровь помещают в пробирку с антикоагулянтом (например, с этилендиаминтетрауксусной кислотой); исследования необходимо проводить по возможности быстро. Обнаружение простейших проводят микроскопией толстых и тонких мазков.

Толстые мазки готовят из больших объёмов крови, нанесённых на предметное стекло; их обычно окрашивают по РоманЏвскому–ГЋмзе, чего обычно бывает вполне достаточно для выявления паразитов.

Тонкие мазки готовят для облегчения морфологической дифференцировки паразитов крови, мазки обычно окрашивают по РоманЏвскому–ГЋмзе или РЊйту.

Образцы различных тканей отбирают, учитывая биологию паразита и его типичную локализацию. Образцы кожных покровов окрашивают обычными гистологическими красителями и микроскопируют. Биоптаты лимфатических узлов, селезёнки, печени, аспираты костного мозга и СМЖ забирают при подозрении на трипаносомозы или лейшманиозы. Часть образцов микроскопируют в виде нативных мазков, часть окрашивают по РоманЏвскому–ГЋмзе или РЊйту. Также возможно окрашивание образцов различными гистологическими красителями, наиболее употребляемыми для изготовления препаратов из исследуемых тканей.

Выделение возбудителей

Выделение возбудителей проводят только в специализированных лабораториях, институтах и центрах; проводить эти мероприятия в обычных бактериологических лабораториях недопустимо. На специальных средах и культурах тканей можно выделять и культивировать практически все патогенные простейшие.

Серологические исследования

Серологические исследования — наиболее распространённые и доступные диагностические методы. Их часто проводят при подозрении на токсоплазмоз, амебиаз (РНГА, латекс-агглютинация), лейшманиозы (РНГА), трипаносомозы (РНГА, РСК) и т.д.

Глава 12

· Грамположительные кокки

Грамположительные кокки представлены стафилококками и стрептококками — основными возбудителями гнойно-воспалительных поражений у человека. Отличительные особенности стафилококков и стрептококков:

• отсутствие способности к спорообразованию,

• сферическая форма

• положительная окраска по ГрЊму.

Стафилококки

Стафилококки относят к отделу Firmicutes, семейству Micrococcaceae, роду Staphylococcus. Бактерии распространены повсеместно; колонизируют кожные покровы и поверхности слизистых оболочек человека и животных. Первых представителей рода выделили Кох (1878) и ПастЌр (1880) из очагов гнойных поражений у человека. Представлены неподвижными клетками диаметром 0,5–1,5 мкм (рис. 12 – 1). В мазках расположены одиночно, парами или гроздьями (рис. 12 – 2). Свойство образовывать скопления, напоминающие гроздья винограда в результате деления во взаимно перпендикулярных плоскостях, определило их название [от греч. staphyle, виноградная гроздь, + kokkos, зерно, ягода]. Основные дифференцировочные признаки стафилококков — характерная морфология и положительная окраска по ГрЊму. Температурный оптимум 30–37 °С. Стафилококки устойчивы к повышенному содержанию хлорида натрия и хорошо растут на средах с содержанием 5–10% NaCl (что и учитывают при приготовлении дифференциально-диагностических сред). На плотных средах через 18–24 ч культивирования в аэробных условиях бактерии формируют мутные круглые ровные колонии кремового, жёлтого или оранжевого цвета. Образующиеся липохромные пигменты защищают бактерии от действия токсических кислородных радикалов. Стафилококки каталаза - положительны; содержат цитохромы, но обычно оксидаза - отрицательны. Бактерии проявляют высокую биохимическую активность: восстанавливают нитраты, вырабатывают H₂S, разлагают мочевину и ферментируют многие углеводы с образованием кислоты. У стафилококков выделяют более 50 антигенных субстанций, разделяемых на родовые, видовые и типовые Аг. Многие стафилококки признаны аллергенами. Родовые Аг нередко способны перекрёстно реагировать с изоантигенами клеток организма человека (эритроцитов, почек и др.), что может привести к развитию аутоиммунной патологии. Видоспецифичными Аг стафилококков могут служить тейхоевые кислоты. Для S. aureus видоспецифичным Аг также является белок А. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10–12 ч. Они довольно устойчивы к нагреванию — при 70–80 °С погибают за 20–30 мин, при 150 °С — за 10 мин; сухой жар убивает их за 2 ч. Бактерии менее устойчивы к действию дезинфицирующих средств, но резистентны к чистому этанолу. По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы. Среди коагулаза-положительных стафилококков для человека патогенен лишь S. aureus. Из коагулаза-отрицательных видов поражения у человека вызывают S. epidermidis и S. saprophyticus (табл. 12 – 1).

Ы Вёрстка! Рисунок 12 - 01

Рис. 12 – 1. Микрофотография отдельной клетки Staphylococcusaureus. Бактерия имеет характерную округлую форму и хорошо выраженную капсулу.

Ы Вёрстка! Рисунок 12 - 02

Рис. 12 – 2. Микрофотография культуры Staphylococcusaureus. Видны грамотрицательные кокки, образующие характерные скопления, напоминающие гроздья винограда.

Таблица 12 – 1. Основные инфекционные заболевания человека, вызываемые патогенными стафилококками

Тип поражения	Возбудитель
Кожные гнойничковые инфекции	S. aureus
Раневые инфекции	S. aureus
Бактериемия	S. aureus, S. epidermidis
Эндокардиты	S. aureus, S. epidermidis
Пневмонии	S. aureus
Артриты:
естественных суставов	S. aureus
инфицирование суставных протезов	S. epidermidis
Остеомиелиты	S. aureus
Инфицирование сосудистых катетеров, установленных на длительный срок	S. aureus, S. epidermidis
Инфицирование сосудистых протезов	S. aureus, S. epidermidis
Перитониты, развивающиеся после перитонеального диализа	S. aureus
Глазные инфекции	S. epidermidis
Инфекции мочевыводящей системы	S. aureus, S. epidermidis
Синдром «ошпаренной кожи»	S. aureus
Синдром токсического шока	S. aureus
Пищевые токсикоинфекции	S. aureus

Золотистый стафилококк (S. aureus)

Эпидемиология

Бактерии колонизируют слизистые оболочки носовой полости и носоглотки, кожные покровы (особенно подмышечных областей и промежности). Золотистый стафилококк также обитает в толстой кишке и влагалище. В соответствии с носителем бактерии разделяют на 10 экологических вариантов (эковаров) — hominis, bovis, ovis, equi и др. S. aureus часто выявляют у новорождённых, но в течение нескольких месяцев количество носителей резко сокращается, и основную группу составляют лица старшего возраста (микроорганизм выделяют у 15–50% клинически здоровых взрослых лиц). Временное носительство отмечают у 60% людей, но в большинстве случаев оно продолжается несколько недель или месяцев. Как правило, повторно организм инфицируется другим штаммом. Хроническое носительство типично для персонала медицинских учреждений; пациентов, страдающих атопическими дерматитами, а также лиц, регулярно получающих инъекции различных препаратов (наркоманы, больные сахарным диабетом и т.п.). Для эпидемиологии госпитальных поражений характерен весь комплекс факторов, типичный для любого нозокомиального патогена: увеличение количества носителей среди медицинского персонала, формирование специфичных «госпитальных штаммов» (эковаров), увеличение числа пациентов с повышенной восприимчивостью, появление новых «ворот» для инфицирования за счёт широкого внедрения в практику инвазивных диагностических методов и др.

• Эпидемическую опасность представляет наличие 10 млн микробных тел в 1 мл носового отделяемого.

• Подавляющее большинство инфекционных заболеваний, вызываемых стафилококками, носит эндогенный характер. Механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя из участков колонизации на травмированную поверхность; существенную роль играют также тесные контакты с носителями и лицами, страдающими стафилококковыми поражениями.

Патогенез поражений

Факторы патогенности возбудителя — адгезины, капсула, компоненты клеточной стенки, ферменты и токсины. Учитывая высокую частоту носительства S. aureus среди практически здоровых лиц, его следует считать не патогенным, а скорее условно-патогенным микроорганизмом. Другими словами, стафилококковые инфекции носят, как правило, вторичный характер и протекают в виде гнойно - воспалительных поражений.

Адгезины — поверхностные белки, взаимодействующие с различными веществами: муцином слизистых оболочек, протеогликанами соединительной ткани, белками внеклеточного матрикса и др.

Капсула защищает бактерии от комплемент-опосредованного поглощения полиморфноядерными фагоцитами, способствует адгЌзии микроорганизмов и их распространению по тканям. При выращивании in vitro капсула обычно не образуется.

Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций: усиливают синтез ИЛ-1 макрофагами, активируют систему комплемента и служат мощными хемоаттрактантами для нейтрофилов.

• Тейхоевые кислоты активируют систему комплемента по альтернативному пути, свёртывающую и калликреин-кининовую системы, а также облегчают адгЌзию бактерий к эпителиальным поверхностям. Тейхоевые кислоты способны ингибировать поглотительную активность фагоцитов.

• Белок А (агглютиноген А) неспецифически связывает Fc-фрагменты молекул IgG (что активирует систему комплемента по классическому и альтернативному путям) и усиливает активность естественных киллеров. Белок А проявляет свойства суперантигена, что совместно с активацией комплемента приводит к проявлению различных местных и системных реакций (например, анафилаксии, фенЏмена Артњса, угнетению активности фагоцитов и т.д.).

Ферменты проявляют разнонаправленное действие, часто не связанное непосредственно с патогенным эффектом.

Каталаза разрушает Н₂О₂, защищая бактерии от действия токсических кислородных радикалов.

†-Лактамазы разрушают молекулы †-лактамных антибиотиков; синтез ферментов кодируют плазмидные гены. Поскольку гены резистентности часто входят в состав транспозонов, они быстро распространяются в популяции. Особое значение имеют метициллин-резистентные штаммы, содержащие дополнительный ген, кодирующий синтез пептидогликановой транспептидазы, что обеспечивает повышенную устойчивость к †-лактамным антибиотикам (см. также главу. 9).

Липазы облегчают адгЌзию и проникновение в ткани. В частности, ферменты способны разрушать сальные «пробки», облегчая проникновение стафилококков в волосяные фолликулы.

Коагулаза вызывает свёртывание плазмы крови. Сам фермент не взаимодействует с фибриногеном, а образует тромбиноподобное вещество, предположительно взаимодействующее с протромбином. Образующаяся фибриновая плёнка играет роль своеобразной дополнительной капсулы, защищающей бактерию.