Устройство световых микроскопов и техника микроскопирования. Особенности строения

КЛЕТОК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

 

Цели занятия:

· Изучить устройство светового микроскопа, освоить методику установки света, технику приготовления и микроскопирования временных препаратов.

· Познакомиться со строением клетки, научиться отличать прокариотические клетки от эукариотических.

· Научиться правильно оформлять отчет о лабораторной работе.

 

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Биология как наука. Методы биологии.
2. Основные концепции биологии.
3. Основные свойства живых систем.
4. Уровни организации живой материи.
5. Современное определение жизни и живого организма.

6. Основные положения современной клеточной теории.

7. Надцарства (империи) и царства живых организмов.

8. Строение прокариотической клетки.

9. Уметь показать на микроскопе механическую, оптическую и осветительную части и рассказать об их устройстве.

10. Какие бывают окуляры; объективы и их фокусное расстояние. Особенности иммерсионного объектива.

11. Что такое увеличение и разрешающая способность микроскопа?

12. Настройка освещения по методу светлого поля.

13. Основные правила работы с оптическим микроскопом.

14. Постоянные и временные микропрепараты. Основные этапы приготовления временных микропрепаратов.

 

Оборудование и материалы:

1. Микроскоп Микмед -5 или аналог.

2. Предметные и покровные стекла, чашки Петри, стаканчики с водой, глазные пипетки, пинцеты, ножницы, кусочки ваты, иммерсионное масло.

3. Постоянные микропрепараты: фиксированные окрашенные мазки культур сенной палочки и сарцины, крови лягушки.

4. Материалы для приготовления временных препаратов: 2-3 головки репчатого лука.

5. 0,01% раствор метиленовой сини, раствор иода.

РАБОТА 1.1. Изучение устройства светового микроскопа

Световая микроскопия – один из основных методов изучения биологических объектов, поэтому владение техникой микроскопирования необходимо для всех последующих занятий по биологическим наукам, а также для практической деятельности микробиолога.

Рассмотрим конструкцию световых микроскопов на примере микроскопа отечественного производства Микмед - 5. Световой микроскоп состоит из трех основных частей: механической, осветительной, оптической. К механической ч а с т и относятся: штатив, револьверное устройство, макро- и микрометрические винты, предметный столик (рис.1).

 

Рисунок 1 – Устройство светового микроскопа Микмед -5

1 – окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 – винт крепления насадки; 4 – револьверное устройство; 5 – объективы; 6 – штатив; 7 – предметный столик; 8 – кольцо;
9 – рукоятка механизма грубой фокусировки (кремальера); 10 – рукоятка механизма микрометрической фокусировки; 11 – выключатель; 12 – рукоятка регулирования яркости источника света; 13 – винт крепления конденсора; 14 – конденсор; 15 – основание штатива; 16 – препаратоводитель; 17 – рукоятка перемещения объекта в продольном направлении; 18 – рукоятка перемещения объекта в поперечном направлении; 19 – коллектор в корпусе

 

Штатив состоит из массивного основания и изогнутого под углом тубусодержателя. Основание имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на рабочем столе.

В верхней части тубусодержателя имеется головка для закрепления бинокулярной насадки и гнездо с винтовой нарезкой для револьвера. Тубус (окулярная трубка) представляет собой полую трубку, в верхнюю часть которой вставляется окуляр.

Револьвер (от лат. revolvo – вращаю) – это вращающийся диск с четырьмя гнездами для ввинчивания объективов.

Винт грубой фокусировки микроскопа – макрометрический винт, или кремальера – расположен с левой стороны штатива. С помощью этого винта предметный столик передвигается в вертикальном направлении вверх и вниз на большое расстояние. Макрометрический винт используется при слабом увеличении, когда объект изучается главным образом в одной плоскости.

Рукоятки микрометрической фокусировки (они - меньшего диаметра)расположены с обеих сторон штатива,используются при сильном увеличении и позволяют при их использовании рассматривать детали объекта, лежащие на разной глубине. Ими следует пользоваться только тогда, когда при помощи кремальеры объект поставлен точно в фокус.

Предметный столик представляет собой четырехугольную пластину с отверстием в центре, над которым помещают предметное стекло с изучаемым объектом. Во избежание смещения, предметное стекло фиксируют специальным прижимом препаратоводителя. Справа под предметным столиком находятся рукоятки механизма координатного перемещения, с помощью которого препарат можно передвигать в поперечном и продольном направлениях.
Осв е т и т е л ь н а я ч а с т ь микроскопа состоит из осветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и съемного светофильтра.
Осветитель встроен в основание штатива. Он включается с помощью выключателя, расположенного на боковой поверхности штатива справа от наблюдателя. Яркость источника света можно изменить, вращая рукоятку регулирования яркости источника света (расположена на штативе справа, под выключателем).
Держатель патрона галогенной лампы прикреплен к основанию штатива двумя винтами снизу, доступ к которым обеспечивается при наклоне прибора. Винты в отжатом состоянии позволяют перемещать держатель патрона с лампой в бобовидных отверстиях основания в случае неравномерного освещения объекта. Если в данном микроскопе источником света является светодиод, то его перемещение при настройке освещения не требуется.

Конденсор находится под предметным столиком, состоит из двух линз, закрепленных в общую оправу, вставлен в кронштейн, который крепится к предметному столику. Для перемещения конденсора служит специальная рукоятка, расположенная слева от наблюдателя. Меняя положение конденсора, можно изменять интенсивность освещения объекта: при опускании освещенность уменьшается, при поднимании – увеличивается.

Ирисовая диафрагма вмонтирована в нижнюю часть конденсора. Она представляет собой кольцо с подвижно укрепленными стальными пластинками, которые могут сдвигаться и раздвигаться с помощью особой ручки; в центре остается отверстие для прохождения светового пучка. Диафрагма позволяет регулировать величину светового потока; максимально суженная, она способствует наибольшей четкости изображения.

О п т и ч е с к а я ч а с т ь микроскопа представлена окулярами и объективами.

Окуляр (от лат. oculus – глаз) помещается в верхней части тубуса и обращен к глазу. Окуляр представляет собой две линзы, заключенные в металлическую гильзу. По числу на верхней плоскости окуляра можно судить о кратности его увеличения (х7, х10, х15). Окуляр можно вынимать из тубуса и заменять по мере необходимости другим.

Объектив – это система линз, укрепленных в общей металлической оправе. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и имеют различную кратность увеличения, которая обозначена числом на их боковой поверхности. Различают объективы малого увеличения (х4 и х10), объектив большого увеличения (х40) и иммерсионный объектив (х100), используемый для изучения наиболее мелких объектов.

Все объективы по способу применения делят на сухие и иммерсионные (от лат. immersio – погружаю или окунаю). У сухих объективов между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух. Воздух и стекло имеют разные показатели преломления света (соответственно 1,0 и 1,52), в результате чего лучи света, переходя из одной среды в другую, преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых объектов (рис.2). У иммерсионных объективов пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено, как правило, кедровым маслом или водой. Предметное стекло, стекло объектива и кедровое масло имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1,515), поэтому лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, рассматриваемые объекты не искажаются. Показатель преломления света, близкий к таковому стекла, имеют и другие вещества, которые используются в качестве иммерсионных составов: касторовое масло (1,48-1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515).

Рисунок 2 – Ход лучей между конденсором и объективом микроскопа

Справа – сухой объектив, слева – иммерсионный. 1 – линза объектива; 2 – верхняя линза конденсора; 3 – предметное стекло; 4 – объект; 5 – покровное стекло; 6 – иммерсионное масло; 7 – воздух. АБ – луч света, проходящий через воздушную среду, отклоняется и не попадает в объектив; ВГ – луч света, проходящий через иммерсионное масло, попадает в объектив.

 

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Эта величина, однако, не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может быть как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Под последней понимают минимальное расстояние между двумя видимыми точками, когда они еще не сливаются в одну, т.е. чем лучше разрешающая способность, тем меньший объект можно увидеть.

Разрешающая способность светового микроскопа определяется в основном дифракцией световых лучей и равна примерно половине длины волны используемого света. Освещая препарат светом с более короткой длиной волны (голубым или синим), можно увидеть более мелкие объекты; при этом разрешающая способность микроскопа близка к 0,2 мкм. С этой целью микроскоп укомплектован синим светофильтром.

ЗАДАНИЕ. Ознакомьтесь с устройством световых микроскопов. Найдите и назовите все их основные части.

 

РАБОТА 1.2. Приготовление временного препарата.

Настройка освещения

 

Наилучшие результаты при работе с микроскопом могут быть получены лишь при условии правильного освещения объекта. Вот один из способов установки света на микроскопе Микмед - 5.

1. Для настройки микроскопа приготовьте препарат, который представляет собой два положенных крест-накрест волоса. Для приготовления этого временного препарата отрежьте ножницами часть волоса длиной примерно 3 см, разрежьте его пополам и поместите оба кусочка друг на друга на предметное стекло, сделав перекрест. Затем глазной пипеткой нанесите на волосы каплю воды и накройте покровным стеклом.

Постарайтесь избежать образования пузырьков воздуха под покровным стеклом: возьмите покровное стекло за боковые грани и прикоснитесь его ребром к поверхности капли воды с краю так, чтобы вода растеклась по ребру покровного стекла, затем осторожно опустите (уроните) покровное стекло на предметное. Научитесь брать каплю жидкости такого объема, чтобы она заполнила все пространство под покровным стеклом. Слишком малая капля жидкости не заполнит всего пространства, и оставшийся в виде пузырьков воздух затруднит работу. Взяв слишком большую каплю, вы увидите, что вода выступила за пределы покровного стекла. В этом случае избыток воды нужно удалить полоской фильтровальной бумаги.

Препарат поместите на предметный столик и закрепите его прижимом препаратоводителя. Поставьте место перекреста волос точно в центр светового пучка. Вместо указанного препарата может быть использован любой другой препарат, детали которого хорошо различимы при малом увеличении.

2. Установите в рабочее положение объектив малого увеличения (х4). Когда объектив займет срединное положение над отверстием столика, в револьвере сработает защелка, при этом будет слышен легкий щелчок, и револьвер фиксируется. Поднимите конденсор до упора. При переходе к объективам других увеличений положение конденсора по высоте не менять.

3. Смотря сбоку, с помощью макрометрического винта поднимите предметный столик почти до соприкосновения объекта с с фронтальной линзой объектива. Глядя в окуляр, медленным вращением кремальеры в обратном направлении осторожно опускайте предметный столик до тех пор, пока в поле зрения не появятся очертания объекта. С помощью рукоятки механизма микрометрической фокусировки добейтесь резкого изображения объекта.
4. Выньте окуляр из правой окулярной трубки бинокулярной насадки. Наблюдая в окулярную трубку, раскройте апертурную диафрагму конденсора до размера выходного зрачка объектива.
5. Установите окуляр в окулярную трубку, наблюдайте поле зрения окуляра. При неравномерно освещенном поле зрения отцентрируйте лампу, как указано в руководстве по эксплуатации. Для достижения наилучшего качества изображения рекомендуется для каждого объектива прикрывать апертурную диафрагму конденсора на 1/3 выходного зрачка объектива, а также использовать синий светофильтр.
Нормальная работа осветительной системы обеспечивается только при использовании предметных стекол толщиной 1 – 2 мм.

ЗАДАНИЕ. Приготовьте микропрепарат и настройте освещение, как указано выше.