Диффузионные методы менее точны, чем методы разведений, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность к нескольким ЛС одновременно. Поэтому их чаще применяют на практике.

Исходный метод. Чашки ПЌтри заполняют питательной средой, соответствующей пищевым потребностям возбудителя, слоем в 4–5 мм. После застывания агар подсушивают в термостате при 37 °C в течение 20 мин. Посев тест-культуры можно осуществлять внесением в полуостывший агар, но чаще микробную взвесь наслаивают на агар. После равномерного распределения по поверхности излишки взвеси удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемых препаратов, после чего инкубируют 18 ч при 37 °C (срок инкубации может варьировать в зависимости от скорости роста микроорганизма). Активность учитывают, измеряя диаметр зоны подавления роста для каждого препарата.

Метод дисков. В настоящее время вместо классического (исходного) метода повсеместно применяют модификацию, предложенную КЋрби и БЊуэром и признанную стандартным тестом (рис. 9 – 13). После посева тест-культуры на агар наносят диски из фильтровальной бумаги, пропитанные различными антимикробными препаратами (используют коммерческие образцы, содержащие известные концентрации). После инкубации при 37 °C в течение времени, необходимого для роста выделенного возбудителя, проводят определение диаметра зоны торможения роста. Размеры зон, полученные в опыте, сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкциях, прилагаемых к дискам, после чего выделенные микроорганизмы относят к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным.

Ы Вёрстка. Вставить рисунок 9–13

Рис. 9 – 13. Метод дисков для стандартного определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным агентам. Диски из фильтровальной бумаги, пропитанные препаратами в известных концентрациях, нанесены на поверхность агара, засеянного тест-культурой. При наличии чувствительности к ЛС через 18 ч культивирования при 37 °С вокруг дисков образуются зоны задержки роста (указаны стрелками).

Определение способности к образованию †-лактамаз

Среди многочисленных методов наибольшее распространение получил †-лактамазный тест — метод с использованием дисков, пропитанных нитроцефином — цефалоспорином, изменяющим окраску диска при гидролизе антибиотика (рис. 9 – 14). После нанесения на колонию бактерий, продуцирующих †-лактамазы, диска с нитроцефином последний через 10 мин (для стафилококков через 60 мин) изменяет окраску с желтоватой на коричнево-малиновую.

Ы Вёрстка. Вставить рисунок 9–14

Ы Вёрстка. В подписи к рисунку 9–14 имеется БЕТА в Alexisn среди символов Arial Cyr

Рис. 9 – 14. Определение способности бактерий продуцировать † - лактамазы. На чашку Петри, засеянную двумя различными культурами бактерий, нанесены два диска с нитроцефином. Культура, продуцирующая †-лактамазы, вызывает потемнение диска (слева). Бактерии, не продуцирующие фермент, окраску диска не изменяют.

• Положительный результат указывает, что бактерии резистентны ко всем †-лактамаза-чувствительным пенициллинам. Метод не следует применять для определения чувствительности к цефалоспоринам.

• Отрицательный результат не всегда свидетельствует о чувствительности бактерий к пенициллинам, так как в ряде случаев резистентность может быть обусловлена изменениями структуры пенициллин-связывающих белков.

• Следует помнить, что способностью образовывать †-лактамазу обладают многие бактерии, и результаты теста следует рассматривать не более как полезную информацию для ограниченного числа клинически значимых организмов: Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, стафилококков, стрептококков и грамотрицательных анаэробов (при инфекциях, вызванных ими, результаты теста вполне информативны).

Выявление метициллин-резистентных стафилококков

Определение проводят при помощи полосок фильтровальной бумаги, содержащих 25 мкг метициллина (рис. 9 – 15). Предварительно производят посев исследуемой культуры и устойчивого эталонного штамма (для контроля качества полосок) параллельными штрихами. При наличии чувствительности к метициллину исследуемые бактерии образуют зоны задержки роста вокруг полоски.

Ы Вёрстка. Вставить рисунок 9–15

Рис. 9 – 15. Определение устойчивости к метициллину у стафилококков. На чашку Петри произведён посев эталонной культуры, устойчивой к метициллину (вверху), и исследуемой культуры бактерий (внизу). Перпендикулярно линии посева нанесена полоска фильтровальной бумаги, содержащая 25 мкг метициллина. После 18 ч инкубирования при 37 °С исследуемая культура образовала зоны задержки роста вокруг полоски бумаги (отмечены стрелками), что указывает на её чувствительность к антибиотику.

Определение чувствительности к антибиотикам у анаэробных бактерий

Определение чувствительности к антибиотикам у анаэробных бактерий проводят сравнительно редко, например, при изучении нового ЛС, периодическом обследовании микробной флоры в стационарах, иногда индивидуально у некоторых пациентов. Используя соответствующую питательную среду, можно применять практически все изложенные в этой главе методы, исключая метод дисков. Следует помнить, что устойчивость к †-лактамным антибиотикам у грамотрицательных анаэробов in vitro часто обусловлена как способностью образовывать †-лактамазы, так и гидролизом самих препаратов (например, имипенема или цефокситина). Наиболее употребим метод серийных разведений в агаре.

Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам

В настоящее время разработаны компьютеризованные системы, автоматически проводящие выделение бактерий из исследуемых образцов и определяющие их чувствительность к различным ЛС. Их основное достоинство — освобождение персонала бактериологических лабораторий от большого объёма рутинных исследований и чёткая стандартизация полученных результатов. Широкое распространение этих устройств в отечественной практике ограничивает их стоимость. Среди более доступных методов наибольшее распространение нашли система Alamar и Е-тест, совмещающие в себе достоинства метода серийных разведений и метода дисков.

Автоматические системы учёта результатов метода серийных разведений (например, Baxter MicroScan AutoSCAN-4) — автоматизированные инкубационные системы со встроенными фотометрами, нефелометрически регистрирующими рост бактерий или его отсутствие через 24 ч после внесения микроорганизмов в лунки микропанелей. Принцип действия основан на учёте разницы оптической плотности среды в лунках, где есть рост бактерий, и в лунках, где его нет. В настоящее время разработаны устройства (например, VITEK), позволяющие получить результаты уже через 4–10 ч.

Система Alamar представляет собой панель с лунками, в каждую помещены диски из фильтровальной бумаги, содержащие различные концентрации антимикробных препаратов и пропитанные индикатором Alamar Blue. После внесения в лунку бактерий диск синеет, а при их дальнейшем росте его окраска меняется на розовую. Порядок размещения дисков в лунках соответствует двойным серийным разведениям препарата. Последняя лунка с синим диском, предшествующая лункам с порозовевшими дисками, соответствует МИК препарата.

Е - тест [от англ. e llipse, эллипс, так как при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы] — модификация метода дисков, но вместо последних используют полоски из фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями препаратов, каждая из этих зон имеет соответствующую маркировку. Полоски помещают на поверхность агара. Если бактерии чувствительны к действию препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, образуется эллипсовидная зона. Её форма обусловлена действием сразу нескольких концентраций препарата. МИК соответствует участок полоски, где её пересекает граница зоны задержки роста (рис. 9 – 16).

Ы Вёрстка! Рисунок 09 - 16

Рис. 9 – 16. Е - тест. На чашку Петри, засеянную исследуемой тест культурой, наносят Е-тест полоску (полоску фильтровальной бумаги, пропитанную различными концентрациями ЛС) таким образом, чтобы участок с наименьшей концентрацией располагался ближе к центру, а участок с наибольшей концентрацией — ближе к периферии. Поскольку разные концентрации ЛС вызывают образование зон задержки роста различной величины, образуется зона задержки роста, напоминающая эллипс. Участок полоски, вокруг которого начинается зона задержки роста, соответствует МИК (указан стрелкой).