Для приготовления окрашеных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

Отбор материала. Тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу (рис. 11 – 8, А); с их помощью также готовят мазки из непрозрачных жидкостей, например взвеси испражнений (рис. 11 – 8, Б). Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенцией готовят их растиранием между двумя предметными стёклами (рис. 11 – 9). Прозрачные жидкости (например, мочу или СМЖ) можно нанести в виде капли на предметное стекло (рис. 11 – 10, А), при этом границы капли желательно обвести маркёром. Лучшие результаты даёт предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной палочки (рис. 11 – 10, Б).

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–08.

Рис. 11 – 8. Приготовление мазков из материала с тампонов (А) и непрозрачных жидкостей (Б). Пояснения в тексте.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–09.

Рис. 11 – 9. Приготовление мазков из материала со слизистой оболочки или грубой консистенцией. Пояснения в тексте.

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–10

Рис. 11 – 10. Приготовление мазков из прозрачных жидкостей (А) и из осадка после центрифугирования (Б). Пояснения в тексте.

Фиксация. В практический бактериологии наиболее распространена термическая фиксация (над пламенем горелки) — метод грубый, но сохраняющий морфологию и отношение к красителям у бактерий. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращающие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие макромолекулы путём химического их сшивания. Для светооптической микроскопии используют формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость КарнуЊ, ацетон, пары осмиевой кислоты и др. Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нанося фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

Окрашивание. Стандартные красители, используемые для окраски бактерий, — карболовый фуксин ЦЋля, фуксин ПфЊйффера и метиленовый синий по Лёффлеру. Для получения более информативных результатов в светооптической микроскопии используют специальные и дифференцирующие методы окраски.

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы ГрЊма и ЦЋля–НЋльсена (рис. 11 – 11).

Ы Вёрстка Дать портрет Грама, файл: Грам

Ханс Христиан Грам

Ы Вёрстка Дать портрет Циля, файл: Циль

Франц Циль

Ы ВЁРСТКА Рисунок 11–11.

Рис. 11 – 11. Схема окраски бактерий по Граму и Цилю – Нильсену.

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы ХЋсса, ЛЌйфсона и АнтЏни; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO₄.

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, БЌйли, ГрЌя и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата [обычно растворами таннина, KАl(SO₄)₂, HgCl₂] и последующая окраска (чаще карболовый фуксин ЦЋля).

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод ПЌшкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

Питательные среды для культивирования бактерий

Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать вещества, утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов.

Универсальные источники азота и углерода — белковые гидролизаты (содержат полный набор аминокислот), пептиды и пептоны. Универсальные источники витаминов и микроэлементов — экстракты белков животного или растительного происхождения и белковые гидролизаты.

рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность бактерий сопровождается сдвигом рН в кислую или щелочную сторону, что требует внесения в среды различных буферных систем (обычно применяют фосфатный буфер). Сбалансированные среды отличают высокая буферность и стабильный оптимум рН. Важно также создание оптимальной концентрации О₂ и СО₂.

Классификации сред

Среды классифицируют по консистенции, составу, происхождению, назначению и загрязнённости материала.

По консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие.

По составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.

По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).

Искусственные среды разделяют на животные [например, мясо-пептонный агар (МПА) или мясо-пептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования (универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

По загрязнённости материала. Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контаминации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селективные (только для отдельных бактерий), дифференциально - диагностические (для облегчения идентификации) среды.

Характеристики сред

Консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда ТЋга), гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl₂, раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия (среда БенгсЊнга–Эллиота).

Среды обогащения (например, среда КЋтта–ТарЏцци, селенитовый бульон, тиогликолятная среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества — соли жёлчных кислот, тетратионат Na⁺, теллурит К⁺, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.

Элективные и селективные среды (например, среды УЋлсона–Блэра, Эндо, ПлЏскирева, Мак-КЏнки) предназначены для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры. Среды готовят с учётом биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Соответственно, выделяют кровяные и сывороточные среды (например, Лёффлера, БордЌ–Жангђ), яичные среды (например, ЛёвенштЊйна–ЙЌнсена) и др.

Дифференциально - диагностические среды (например, среды ХЋсса, КлЊрка) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон ХоттЋнгера–МартЌна, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спиртами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды также часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор АндрЊде, бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом АндрЊде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив АндрЊде и индикатор бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разделяют на четыре основные группы.

Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатина, молоко и др.), применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространены мясо-пептонная желатина (МПЖ), свернувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда МинкЌвича) и среды ХЋсса. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).

Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный, индигокармЋн), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее известны цитратный агар СЋммонса и цитратная среда КЏзера.

Посев и культивирование

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре СабурЏ и т.д.). Для выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а также поглотители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, древесный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.