Сложные реакции называются так потому, что состоят из нескольких простых реакций.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) предложена Ж. БордЌ и О. Жангђ. Реакция включает две фазы (рис. 10 – 18). В фазе I (специфической) искомый Аг (или АТ) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент. В фазе II (индикаторной) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы — эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей АТ к ним. Если Аг и АТ не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит–антиэритроцитарное АТ. Следствие этого — гемолиз индикаторных клеток (фенЏмен «лаковой крови») — реакцию считают отрицательной. Если в фазе I АТ и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной. Основные недостатки РСК: сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов [их необходимо готовить прямо перед постановкой реакции (комплемент) либо за несколько суток (эритроциты барана)] и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Тем не менее, РСК применяют в диагностике многих заболеваний, например при диагностике сифилиса (реакция ВассермЊнна).

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–18

Рис. 10 – 18. Реакция связывания комплемента. А — отрицательная реакция. Специфические в отношении исследуемого Аг АТ отсутствуют. Образования иммунных комплексов, связывающих комплемент, не происходит. Молекулы комплемента сорбируются на клетках-мишенях (эритроцитах), вызывая их лизис. Б — положительная реакция. Имеющиеся в сыворотке АТ специфически связывают исследуемый Аг, образуя иммунный комплекс. Последний связывает комплемент, и лизиса эритроцитов не наблюдают.

Реакция радиального гемолиза в геле — вариант РСК. Принцип реакции основан на иммобилизации комплемента и Аг (эритроциты барана) в агаровом геле. Затем в геле нарезают лунки и вносят АТ (например, гемолитическую сыворотку). Диффундирующие АТ связывают Аг и комплемент, что проявляется появлением зон гемолиза. Их размеры пропорциональны титрам АТ в сыворотке. В диагностических целях эритроциты барана «нагружают» Аг различных возбудителей (например, вирусов гриппа, краснухи), а в лунки вносят сыворотку больных.

Реакция локального гемолиза в геле предложена Н. ЙЌрне и А. Нордином (1963). Принцип аналогичен реакции радиального гемолиза, но в гель вносят эритроциты барана и суспензию клеток-антителопродуцентов. Последние секретируют АТ, диффундирующие в агар и фиксирующиеся на эритроцитах. Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей АТ к эритроцитам барана. Метод получил широкое распространение во многих областях иммунологии, так как даёт возможность оценивать образование АТ на уровне отдельных тканей и клеточных популяций после различных воздействий. Метод позволяет определять динамику образования антителообразующих клеток к различным Аг, связывая их с эритроцитами, а также определять классы образуемых Ig.

Определение принадлежности АТ к тому ли иному классу Ig имеет большое диагностическое значение, так как позволяют определить фазу инфекционного процесса. На базе классических серологических реакций доступна унитиоловая проба, в основу которой положена способность унитиола расщеплять дисульфидные (S–S) мостики в молекулах IgM, но не IgG. Первоначально в порции сыворотки определяют общие титры АТ (например, в РНГА), затем в неё вносят унитиол и после инкубации снова определяют титры АТ. Разницу между титрами первого и второго измерения составляют титры IgM.

Реакции с применением меченых АТ и Аг

Реакции с использованием меченых АТ и Аг составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и АТ в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители-флюорохромы и изотопы.

Метод радиоиммунного анализа

В основе метода радиоиммунного анализа (РИА) — маркирование радионуклидом Аг или АТ, вступающих в реакцию. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках импульсов. Наибольшее распространение получил радиоиммунный анализ на твёрдой фазе (твердофазный РИА) с использованием меченых Аг или АТ, сорбированных в лунках полистироловых панелей. РИА применяют для выявления микробных Аг, различных гормонов, ферментов и т.д. Широкое распространение метода ограничивает необходимость создания условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклидами.

Метод иммуноферментного анализа

Метод иммуноферментного анализа (ИФА) во многом напоминает РИА, но включает использование коммерческих реагентов — Аг или АТ, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды — в жёлто-коричневый (при использовании пероксидазы) или жёлто-зелёный (при использовании фосфатазы). По сравнению с классическими методами выявления Аг, ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие Аг с АТ в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия — агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность — обычно достаточно присутствия Аг в концентрации 1 нг/мл. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики. Наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Для этого коммерческие моноклональные АТ или Аг фиксируют на лунках пластиковых панелей, куда затем вносят исследуемый материал (содержащий Аг или АТ). Основные варианты твердофазного ИФА представлены на рис. 10 – 19. На практике ИФА широко применяют для выявления Аг Chlamydia trachomatis в мазках из мочеиспускательного канала и влагалища, стрептококков группы А в мазках из зева и токсина Clostridium difficile в фекалиях. Метод позволяет не только выявлять АТ, но и определять их принадлежность к различным классам Ig, например, выявлять IgM к Аг Mycoplasma pneumoniae.

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–19

Рис. 10 – 19. Схема выявления Аг прямым и непрямым методами твердофазного ИФА.

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) разработана А. Кунсом (1941) и основана на применении АТ, меченных флюорохромными красителями. Такие АТ, связывая различные Аг, вызывают свечение иммунных комплексов в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. На практике применяют несколько вариантов РИФ.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг [от англ. blot, пятно] — метод идентификации Аг (или АТ) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют. После отмывания несвязавшихся АТ (при их наличии) проводят ИФА — на плёнку наносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг–АТ–антисыворотка к Ig на носителе появляются окрашенные пятна (рис. 10 – 20).

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–20

Рис. 10 – 20. Иммуноблоттинг. Пояснения в тексте.

Глава 11

· Методы обнаружения микроорганизмов

В этой главе рассмотрены вопросы организации лабораторной микробиологической службы, принципы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, методы выделения и идентификации бактерий, обнаружения вирусов, грибов и простейших.