Ы Вёрстка Портрет (Лёффлер.TIF)

Фридрих Лёффлер

Эпидемиология. Резервуар инфекции — человек (больной, реконвалесцент, бактерионоситель); наибольшую эпидемическую опасность представляют больные лица. Реконвалесценты выделяют дифтерийную палочку в течение 15–20 сут. Основной путь передачи — воздушно - капельный; также возможно заражение через предметы, используемые больным, и инфицированные пищевые продукты (обычно молоко). При комнатной температуре во влажной атмосфере возбудитель сохраняется долго. При 60 °С он отмирает в течение 10 мин; в высушенных плёнках выдерживает температуру 98 °С в течение 1 ч, а при комнатной температуре может сохраняться до 7 мес. На игрушках сохраняется до 2 нед, в пыли — до 5 нед, в воде и молоке — до 6–20 сут, на рассеянном свету остаётся жизнеспособным до 8 ч. Дезинфектанты и антисептики инактивируют бактерии в течение 5–10 мин. Пик заболеваемости приходится на осенне - зимние месяцы.

Морфология и тинкториальные свойства

Дифтерийная палочка (палочка КлЌбса–Лёффлера) представлена тонкими, слегка изогнутыми или прямыми палочками 1–12ѓ0,3–0,8 мкм. Часто они утолщены на концах и напоминают булаву [от греч. coryne, булава]. Для дифтерийной палочки характерен выраженный полиморфизм. Наряду с типичными формами, можно обнаружить карликовые, кокковидные, толстые с колбовидным утолщением на концах, гигантские, клиновидные, нитевидные, ветвящиеся и другие формы. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгЌзию к эпителию слизистой оболочки. У C. diphtheriae выделяют три биовара — gravis, mitis и intermedius.

• Бактерии биовара gravis — короткие неправильной формы, с небольшим количеством метахроматических гранул.

• Биовар mitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие много волютиновых зёрен (тельца БЊбеша–Эрнста).

• Бактерии биовара intermedius наиболее крупные, с бочковидными очертаниями; для них характерны поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов. В настоящее время биовар intermedius относят в группу gravis.

C. diphtheriae хорошо окрашивается оснЏвными анилиновыми красителями, грамположительна (окрашивание не всегда равномерно). Для окраски мазков обычно применяют щелочной метиленовый синий по Лёффлеру либо окрашивают их по НЊйссеру. Бактерии способны образовывать L- и фильтрующиеся формы. В мазках C. diphtheriae располагаются в виде «растопыренных пальцев», «иероглифов», «паркета», латинских букв V, Y, L и т.д. (рис. 14 – 1).

Ы Вёрстка Рисунок 14–01.

Рис. 14 – 1. Микрофотография культуры Corynebacteriumdiphtheriae. Видны грамположительные палочки, располагающиеся в мазках беспорядочными скоплениями, отдалённо напоминающими иероглифы.

Культуральные свойства. Дифтерийная палочка хорошо растёт при 36–37 °С; оптимум рН 7,4–8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы металлов (Са²⁺, Мg²⁺, Fe²⁺ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (например, среде Лёффлера) дают рост уже через 10–12 ч; за это время контаминирующая микрофлора обычно не успевает развиться. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. На таких средах возбудитель образует серовато-чёрные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура, аккумулирующегося внутри бактерий (рис. 8 вклейки). В жидких средах образуют помутнение и осадок; их образование и характер варьируют у различных биоваров.

Биохимическая активность. C. diphtheriae сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, маннит. Способность разлагать крахмал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференцировки. Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способности ферментировать сахарозу и разлагать мочевину — дифференцирующий признак, отличающий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак — способность разлагать цистин. C. diphtheriae продуцирует каталазу, гиалуронидазу, нейраминидазу, ДНКазу, уреазу и др. Цистиназная активность — дифференцирующий признак C. diphtheriae. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика. Биовары возбудителя дифтерии существенно различаются по культуральным (табл. 14 – 1) и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия в способности разлагать углеводы и мочевину (рис. 14 – 2).

Таблица 14 – 1. Культуральные особенности биоваров C. diphtheriae

	Биовар
Свойства	gravis	intermedius	mitis
Рост на средах с теллуритом	Крупные сухие матовые плоские серо-чёрные колонии приподняты в центре, радиальная исчерченность («маргаритки») и неровные края	Мелкие сухие матовые серо-чёрные колонии с более прозрачной периферией, поднятым центром и неровными краями	Мелкие гладкие блестящие полупрозрачные чёрные колонии с ровными краями
Рост на бульоне	Плёнка, помутнение (иногда отсутствует), крошковидный или крупнозернистый осадок	Помутнение с последующим просветлением и образованием мелкозернистого осадка	Равномерное помутнение и порошкообразный осадок
Гемолиз на кровяных средах	±	–	+

Примечание. + — признак положительный; – — признак отрицательный; ± — признак непостоянный.

Ы Вёрстка Рисунок 14–02 (ВНИМАНИЕ! имеется два файла — «а» и «б», расположить вместе).

Рис. 14 – 2. Биохимическая дифференциальная диагностика биоваров Corynebacteriumdiphtheriae на укороченном «пёстром ряду». Идентификацию биоваров дифтерийной палочки проводят по способности разлагать глюкозу (1), мальтозу (2), сахарозу (3), крахмал (4) и мочевину (5). Разложение углеводов приводит к закислению среды и изменению её цвета с жёлтого на красный (в среду добавлен индикатор нейтральный красный). При гидролизе мочевины происходит защелачивание среды за счёт образования аммиака и её посинение (в пробирку добавлен индикатор бромтимоловый синий). Рис. А — бактерии биоваров gravis и intermedius разлагают глюкозу (1), мальтозу (2) и крахмал (4). Рис. Б — бактерии биовара mitis разлагают лишь глюкозу (1) и мальтозу (2). Все биовары дифтерийной палочки не разлагают мочевину (5).

Бактериоцины. Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицЋны), обладающие узким спектром действия. Гены, кодирующие синтез бактериоцинов, передаются плазмидами. Бактериоцины образуют как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы.

Токсинообразование

C. diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин — основной фактор патогенности. Нетоксигенные штаммы не вызывают развитие заболевания. В чистом виде токсин впервые получили Э. Ру и А. ИерсЌн (1888), что явилось решающим моментом для установления этиологической роли микроорганизма. Токсин проявляет все свойства экзотоксина (термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый антитоксической сывороткой). Нативный токсин — полипептид с M_r около 72 000; его образуют фрагменты А (проявляет ферментативную активность) и В (взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновение фрагмента А). Клетки всех чувствительных организмов способны рецептировать В-фрагмент и поглощать молекулу посредством эндоцитоза. В кислой среде эндосом (фаголизосом) дисульфидные связи, объединяющие оба компонента, разрушаются, фрагмент В взаимодействует с мембраной эндосомы, облегчая проникновение фрагмента А в цитоплазму. Последний устойчив к денатурации и длительно сохраняется в цитозоле. Механизм цитотоксического действия связан с модификацией белков через АТФ-рибозилирование. Подобным свойством обладают многие токсины, но лишь дифтерийный токсин и токсин А Pseudomonas aeruginosa имеют специфичную мишень — фактор элонгации 2 — трансферазу, ответственную за наращивание (элонгацию) полипептидной цепи на рибосоме.

Дифтерийный токсин катализирует перенос АТФ-рибозы от цитоплазматического никотинамиддинуклеотида (НАД) к фактору элонгации 2, приводя к АТФ-рибозилированию гистидиновых остатков в молекуле фактора с необратимым блокированием элонгации полипептидной цепи (то есть любого белкового синтеза). Немодифицированный фактор элонгации 2 образует комплекс с ГТФ и тРНК, связывающийся с мРНК в эукариотических клетках, после чего возможно встраивание аминокислот в синтезируемую белковую молекулу. Токсин ингибирует белковый синтез, в том числе и в миокарде, приводя к структурным и функциональным нарушениям, способным вызвать смерть больного. Результат действия токсина на нервную ткань — демиелинизация нервных волокон, часто приводящая к параличам и парезам.

Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, инфицированные бактериофагом (†-фаг), несущим ген tox, кодирующий структуру токсина. Образование последнего наиболее выражено при вступлении бактериальной популяции в стадию отмирания. Переход умеренного фага в литическую форму мало влияет на синтез токсина.

Активность токсина. 1 ЕД Dlm дифтерийного токсина равна наименьшей концентрации, убивающей морскую свинку массой 250 г на 4–5-е сутки (около 0,25–0,1 мкл). Для получения анатоксина (ослабленного нагреванием при 40 °С дифтерийного токсина) используют штамм PW-8 либо его варианты — «Массачуссетс», «Торонто» и др.

Антигенная структура. У C. diphtheriae выделяют О- и К-Аг. Липидные и полисахаридные термолабильные фракции О - Аг коринебактерий преимущественно представлены межвидовыми Аг. Поверхностные термолабильные К - Аг (нуклеопротеиды, белки) обеспечивают видовую специфичность и проявляют выраженную иммуногенность. С помощью анти-К-сывороток дифтерийные бактерии разделяют на серологические варианты (около 58). Биовар mitis включает 40 сероваров, gravis — 14, intermedius — 4. В отечественной практике используют диагностические агглютинирующие, неадсорбированные сыворотки; в том числе полигрупповые и к сероварам для РА на стекле и в пробирках.

Патогенез поражений. Входные ворота для возбудителя — слизистые оболочки носоглотки, иногда глаз, половых органов (у женщин), повреждённые кожные покровы. Дифтерийная палочка колонизирует ткани в месте внедрения, вызывая развитие местного фибринозного воспаления. При этом тип воспаления зависит от строения слизистых оболочек. Например, в однослойном цилиндрическом эпителии дыхательных путей формируется крупозное воспаление, на многослойном плоском эпителии образуется жёлто-серая фибринозная плёнка, плотно спаянная с прилежащими тканями. Подобный тип поражений известен как дифтеритическое воспаление. Разрастание плёнок и переход процесса на воздухоносные пути могут вызвать асфиксию. Системные проявления обусловлены действием токсина, поражающего нервную систему (преимущественно периферические симпатические узлы), сердце и сосуды, надпочечники и почки. Ферменты C. diphtheriae (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин) обеспечивают проникновение возбудителя в различные ткани, включая кровоток. Однако (в отличие от токсинемии) бактериемия клинически не проявляется.

Клинические проявления. Продолжительность инкубационного периода заболевания 2–12 сут. В клинической картине дифтерии выделяют сменяющие друг друга период манифестных проявлений фибринозного процесса и ранних токсических осложнений (первые 5–10 сут), период поздних токсических осложнений (не обязательный, с 10–12 сут до 6 нед), период реконвалесценции (2–3 мес после исчезновения проявлений). В зависимости от локализации процесса выделяют поражения ротоглотки (наиболее часто), дыхательных путей, носа и редкой локализации (глаза, наружные половые органы, кожа, раневые поверхности).