Рост бактерий в периодической культуре

Собственно под ростом бактерий обычно подразумевают координированную репликацию всех компонентов бактерий. Поскольку деление бактериальной клетки приводит к образованию двух особей, то их число растёт в геометрической прогрессии: 2⁰ј2¹ј2²ј2³ј...2ⁿ. Регуляторное действие на рост бактерий оказывают качество питательной среды и условия выращивания. Рост популяции клеток в ограниченном жизненном пространстве (периодическая культура) может быть разделён по меньшей мере на четыре фазы (рис. 4 – 12). После внесения в среду бактерии адаптируются к её условиям и размножаются сравнительно медленно (лаг-фаза). Затем наступает фаза экспоненциального роста (экспоненциальная фаза). Далее среда истощается, в ней аккумулируются токсические продукты метаболизма, что проявляется снижением темпов размножения и прекращением увеличения числа клеток (стационарная фаза). Таким образом, рост в периодической культуре подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. В последующем бактериальная культура может погибнуть либо значительно сократиться (фаза отмирания). Спорообразующие виды переходят в стадию споруляции, у споронеобразующих видов возможно образование анабиотических форм (см. ниже). В некоторых случаях дополнительно выделяют фазу ускорения роста (начало экспоненциальной фазы) и фазу замедления роста (переход к стационарной фазе).

Ы ВЁРСТКА. Рисунок 4–12

Рис. 4 – 12. Рост бактериальной культуры.

Лаг - фаза соответствует периоду физиологического приспособления, включающего индукцию ферментов, синтез и сборку рибосом. Продолжительность фазы зависит главным образом от возраста посевного материала (инокулята) бактерий и предшествовавших условий культивирования. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то бактериям необходимо время для адаптации к новым условиям. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от имевшихся в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может потребовать синтеза новых ферментов, в которых ранее не было необходимости.

Экспоненциальная фаза (логарифмическая) характеризуется максимальной скоростью клеточного деления. Для конкретного вида бактерий в конкретных условиях роста время генерации (то есть время, необходимое для удвоения количества бактерий) постоянно в течение всей логарифмической фазы, но вариабельно у различных видов и штаммов, а также зависит от состава среды и условий культивирования. Время генерации на оптимальной среде может быть коротким (у кишечной палочки 20 мин), либо продолжительным (у Mycobacterium tuberculosis 6 ч). В этой фазе в среде происходит максимальное накопление метаболитов бактерий (например, токсинов, бактериоцинов).

Стационарная фаза. В течение этого периода доступность важнейших питательных веществ становится лимитирующим фактором. Устанавливается равновесие между клеточным ростом и делением и процессом отмирания клеток. Спорообразующие бактерии (например, родов Bacillus и Clostridium) способны переходить в фазу споруляции, активирующуюся при нахождении бактерий в условия ограниченного питания. В определённый момент соотношение отмирающих, вновь образующихся и покоящихся клеток становится стабильным; подобное состояние известно как максимальная стационарная фаза. Биомасса бактерий в стационарной фазе обозначают как «урожай», или «выход биомассы» (разница между максимальной и исходной биомассой); или «экономический коэффициент», если прирост биомассы отнесён к единице лимитирующего рост субстрата.

Фаза отмирания (спада, лизиса) включает период логарифмической гибели, переходящий в период уменьшения скорости отмирания бактерий. Причины гибели бактерий в нормальных питательных средах до конца не ясны. Понятны случаи, когда в среде накапливаются кислоты (при росте Escherichia, Lactobacillus). Иногда бактерии разрушаются под действием собственных ферментов (автолиз). Скорость отмирания широко варьирует в зависимости от условий обитания и особенностей микроорганизма (например, энтеробактерии отмирают медленно, а бациллы — быстро).

Двухфазный рост. У бактерий, способных использовать два различных источника углерода, наблюдают двухфазный рост (так называемая диауксЋя). Примером может служить рост кишечной палочки на среде с глюкозой и сорбитолом.

• Для подобных микроорганизмов характерен начальный пик роста, в течение которого бактерии утилизируют только один углевод.

• После исчерпания его запасов наступает стационарная фаза, в течение которой в культуре инициируются синтез ферментов и механизмы транспорта для утилизации второго углевода.

• Если физиологические условия удовлетворительны, в бактериальной культуре начинается фаза вторичного экспоненциального роста, инициированная утилизацией второго углевода.

Рост без деления. Рост бактерий не всегда сопровождается делением. Многие факторы — детергенты, антибиотики, соли жёлчных кислот, УФ-облучение — задерживают деление клеток. В результате образуются длинные нитевидные формы, значительно превышающие по размерам исходные клетки.

Оценка роста бактерий

Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.

Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, ПетрЏва–ХЊузера или Горќева). Если толщина слоя среды с микроорганизмами 0,02 мм, а сторона квадрата на предметном стекле 0,05 мм (объём 5ѓ10^–8 см³), то количество подсчитанных в квадрате клеток нужно умножить на 2ѓ10⁷, чтобы получить число клеток в 1 мл.

Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве.

Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 °С.

Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца.

Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат.

Биохимические методы определения биомассы основаны на определении общего азота в клетках (метод КьельдЊля), общего углерода (по ван СлЊйку–ФЏлчу), общего белка (по ЛЏури или ФЏлину), поскольку в бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен. В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование СО₂ или кислот).

Факторы, влияющие на рост бактерий

Кроме состава питательных сред, на которых развиваются бактерии, большое значение имеют условия культивирования и, прежде всего, температура, аэрация и концентрация водородных ионов в среде.

Культуральные среды

Культуральные среды обычно компонуют, предварительно зная, рост каких именно физиологических групп микроорганизмов хотят обеспечить. Вначале целесообразно составить минеральную основу, содержащую все необходимые питательные вещества в неорганической форме. Затем в эту основу вводят источники углерода, энергии, азота и необходимые ростовые факторы. В количественном отношении придерживаются простого правила: соотношение важнейших элементов, вводимых в воду, должно быть примерно таким же, как в бактериальной клетке (например, среднее соотношение углерод:азот:фосфор:сера:калий:кальций:магний:железо = 5:1:0,3:0,1:0,1:0,05:0,05:0,02. В граммах эти величины дают примерное содержание элементов на 1 л среды).

• Для культивирования некоторых бактерий применяют простые синтетические среды, то есть среды, содержащие только определённые химические соединения: источник углерода (например, глюкозу), аммонийный азот, а также фосфаты, хлориды и сульфаты, в то время как другим необходима комплексная, или сложная среда, дополненная различными веществами, химический состав которых полностью не определён (например, среда с экстрактами тканей сердца и мозга).

• По консистенции микробиологические среды разделяют на жидкие (бульон) и твёрдые (плотные), содержащие около 2% «уплотнителя» — агара (полисахарида, получаемого из морских водорослей). В некоторых случаях в качестве «уплотнителя» можно использовать желатину. СрЌды с небольшим содержанием агара (0,6%) обозначают как полужидкие. Для промышленного выращивания и автоматизированной диагностики предпочтительна жидкая среда. Выращивание на агаризованных срЌдах необходимо для выделения и дальнейшей оценки отдельных колоний бактерий.

• Элективные среды применяют для выделения определённых типов бактерий. Многие микроорганизмы легко обнаруживаются, так как вызывают заметные изменения в окружающей среде. Выделение этих микроорганизмов в чистой культуре (клоне) не представляет особых трудностей. Однако есть много других микроорганизмов, относящихся к разным физиологическим группам, выделение которых стало доступным лишь после разработки С.Н. ВиногрЊдским и М. БейерЋнком метода накопительных культур, который подразумевает создание условий (источники энергии, углерода и азота, акцептор электронов, свет, температура, рН и т.п.), обеспечивающих преимущественный рост одного микроорганизма в сравнении с остальными. В подобной элективной (селективной) среде наиболее приспособленные бактерии бурно растут, вытесняя контаминирующую микрофлору. Многократный пересев на предпочтительную для данного вида жидкую среду обеспечивает «обогащение» исходной пробы, часто контаминированной другими микроорганизмами. Последующий высев на плотную среду позволяет выделить необходимый штамм. Например, для выделения патогенных энтеробактерий используют элективные плотные среды, к которым добавляют соли висмута, а для обнаружения возбудителя дифтерии — среды с теллуритом. Выросшие на этих средах колонии патогенов, обладающих способностью восстанавливать ионы редких металлов, имеют металлический блеск.

• Некоторые бактерии практически не способны к росту in vitro (например, Mycobacterium leprae, хламидии), что считается проявлением крайней степени паразитизма и связано с утратой ряда важнейших ферментов, необходимых для самостоятельного роста и развития.

Температура

Оптимальная температура роста патогенных для человека микроорганизмов совпадает в основном с температурой тела человека. В отдельных случаях температурный параметр может быть использован как простой способ селекции, например, виды Campylobacter лучше растут при температуре 42 °С, слишком высокой для роста большинства других патогенов. В зависимости от требований к температурному режиму бактерии разделяют на три группы.

Мезофильные бактерии лучше всего растут в пределах 20–40 °С; к ним относят большинство патогенных для человека микроорганизмов.

Термофильные бактерии лучше растут при 50–60 °С.

Психрофильные бактерии предпочитают расти в интервале температур от 0 до 10 °С.

Аэрация

Всем облигатным аэробам в качестве конечного акцептора электронов необходим кислород. При большом объёме жидкости аэробные бактерии могут расти только на поверхности; для роста в глубоких слоях требуется перемешивание. Микроорганизмы могут использовать только растворённый кислород, а его растворимость в воде очень мала (в 1 л при 20 °С содержится 0,28 моля О₂, что хватает для окисления лишь 8 мг глюкозы), поэтому запас кислорода обеспечить невозможно, и он должен поступать к среде непрерывно.

Для обогащения жидкости кислородом увеличивают площадь соприкосновения жидкой и газовой фаз различными способами: культивированием в тонком слое среды, перемешиванием поверхностных и глубоких слоёв жидкости путём встряхивания, вращением сосудов вокруг продольной оси, пропусканием воздуха через жидкость под давлением.

Для полного связывания растворённого кислорода (техника анаэробных культур) предусмотрено применение прокипячённых питательных сред, закрытых без пузырьков воздуха; создание бескислородной атмосферы в специальных установках для культивирования; применение адсорбентов кислорода (дитионита, хлорида одновалентной меди), восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликолата, цистеина или сульфида, если бактерии его переносят).

Концентрация ионов водорода

Установление и поддержание определённой величины рН (логарифм величины, обратной концентрации водородных ионов в молях на литр) имеет существенное значение для роста бактерий. Подавляющее большинство микроорганизмов хорошо растёт при нейтральном рН, равном 7,0. Актиномицеты и бактерии, разлагающие мочевину, предпочитают среды с более высоким рН, то есть слегка щелочные. Некоторые бактерии толерантны к кислой среде (например, лактобациллы). Кислые значения рН предпочитают грибы.

Поддержание рН особенно необходимо для микроорганизмов, продуцирующих кислоты, но не обладающих устойчивостью к ним (кишечные бактерии и псевдомонады). Определённое буферное действие оказывают фосфаты, при более сильном выделении кислот рекомендуется добавлять к среде карбонат кальция или бикарбонат натрия.

Нарушение метаболизма при неблагоприятных значениях рН не связано с прямым действием ионов Н⁺ и ОН^–. Они лишь снижают степень диссоциации слабых кислот и оснований, которые в недиссоциированном состоянии легче проникают в клетку, чем продукты их диссоциации.

Пигменты бактерий

Колонии многих бактерий могут быть ярко окрашены, что связано с выделением окрашивающего вещества в средђ либо окраской самих бактерий. Пигменты бактерий представлены различными веществами — каротиноидами, феназиновыми производными, пирролами, антоцианами и др. Пигменты бактерий — вторичные метаболиты, то есть они не являются веществами, обязательно присутствующими у всех бактерий. Например, даже внутри одного вида Serratia marcescens есть пигментообразующие и беспигментные штаммы. Среди пигментов преобладают жёлтые, оранжевые и красные каротиноидные пигменты. Способность к пигментообразованию выражена у видов Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др. Этот признак генетически детерминирован, поэтому его используют в качестве дифференцирующего критерия.

• Пигменты защищают бактерии от действия видимого света и УФ-лучей. Мутанты, лишённые способности к пигментообразованию, быстро погибают на свету. Искусственно окрашеные бактерии (например, метиленовым синим) также проявляют повышенную лабильность к инсоляции. Бактерицидное действие солнечного света проявляется в присутствии кислорода и обусловлено фотоокислением. При этом клеточные пигменты (флавины и цитохромы) действуют как катализаторы. Каротиноиды ингибируют этот процесс. У некоторых бактерий образование пигментов происходит только на свету (например, каротиноидов у туберкулёзной палочки).

• Многие пигменты проявляют антибиотические свойства. Между пигментацией и образованием вторичных метаболитов существует такая тесная корреляция, что при наличии пигментов можно с большой долей вероятности ожидать образования антибиотиков и других БАВ.

Спорообразование

Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях способны образовывать особые защитные формы — споры [от греч. sporos, семя]. Споры характеризуются высоким коэффициентом светопреломления и располагаются внутриклеточно, поэтому их также называют эндоспоры, а образующие их бактерии — спорЊнгии. Споры образуются лишь внутри вегетирующей бактериальной клетки, и каждая клетка образует одну эндоспору. Спорообразование наблюдают у небольшой группы эубактерий, из патогенных для человека — лишь у видов Clostridium и Bacillus. На долю споры приходится бЏльшая часть сухой массы клетки-спорангия, хотя по объёму спора в 10 раз меньше объёма материнской клетки. Споры — особая форма покоящихся клеток со сведённой к нулю метаболической активностью. Они резистентны к нагреванию, радиации, высыханию и воздействию химических веществ. Благодаря этим свойствам, споры могут длительно сохраняться и обеспечивать сохранение вида в неблагоприятных условиях. Например, в почве, приставшей к растениям гербариев ботанического сада Кью Гарденс (Лондон), пролежавших 200–300 лет, обнаружены жизнеспособные споры Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis. Предположительно в сухой почве некоторое количество спор может сохраняться до 1000 лет, но уже через 50 лет хранения 90% спор теряет жизнеспособность. Основное значение спор в выживаемости бактерий определяет их терморезистентность. Устойчивость к нагреванию (а некоторые споры выдерживают даже кипячение в течение нескольких часов) обеспечивает кальциевая соль дипиколиновой (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислоты, составляющая 10–15% общей массы споры. Единственный фактор, к действию которого споры абсолютно лабильны — открытый огонь. Как тут не вспомнить гётевского Мефистофеля и его рассуждения о неистребимости жизни: «...всё в мире так ведётся, что в воздухе, в воде и на сухом пути, в тепле и в холоде зародыш разовьётся; один огонь ещё, спасибо, остаётся, а то б убежища, ей-богу, не найти».

Помимо эндоспор у некоторых бактерий существуют другие покоящиеся формы — экзоспоры (известны только для метанокисляющих бактерий) и цисты (шарообразная толстостенная клетка у видов Azotobacter). Аналогичные клетки миксобактерий называют миксоспорами. Для медицински значимых микроорганизмов перечисленные типы спорообразования не характерны.

Морфология

Споры бывают круглыми, овальными или эллиптическими; некоторые снабжены «рёбрами жёсткости», усиливающими устойчивость к механическим воздействиям. При микроскопическом исследовании споры выделяются высоким коэффициентом светопреломления, аналогичным таковому у обезвоженного белка. В зрелой споре различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма), двухслойная ЦПМ и оболочка споры (рис. 4 – 13).

Ы ВЁРСТКА. Рисунок 4–13

Рис. 4 – 13. Микрофотография споры возбудителя сибирской язвы. 1 — кортекс; 2 — оболочка споры; 3 — спороплазма.

Спороплазма (протопласт споры) включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового синтеза и некоторые другие (например, анаэробного энергообразования).

Оболочка споры двухслойная; пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму. Внутренний слой (стенка споры) образован пептидогликанами, аналогичными таковым у вегетирующей клетки. Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью.

Экзоспориум. У некоторых бактерий материнская клетка образует экзоспориум — двух-трёхслойное желатинообразное покрытие, образованное липопротеинами и углеводами и во многом аналогичное капсуле бактерий. При созревании споры экзоспориум может сохраняться в виде пустого и отстающего от споры «мешка».

Споруляция

Процесс споруляции (спорообразования) начинается сразу после возникновения дефицита питательных веществ и продолжается приблизительно 8 ч. Никаких внешних источников питания или энергии при этом не требуется. Споруляцию стимулирует внесение в среду глюкозы, фосфора и NH₄; угнетает внесение пептона, лактозы, NaCl, CaCl₂ (у бактерий рода Bacillus — DL-аланина). Споруляция контролируется особыми генами. Их число вариабельно у различных видов и может достигать 70. Для спорообразования важна индукция гена spoO. Его транскрипция запускает последовательную транскрипцию всех остальных необходимых генов (оперонов). Детали спорообразования служат видовыми признаками, но его принципиальные закономерности одинаковы для всех бактерий.

Подготовительная стадия сопровождается прекращением деления и увеличением количества липидных включений.

Стадия предспоры обычно начинается бурно. В клетке появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с изменёнными плотностью и тинкториальными свойствами. Подобное образование обозначают терминами «предспора», или «примордиальная спора».

Третья стадия включает появление оболочки (обычно в течение 10 мин после образования предспоры) и ещё большее увеличение коэффициента светопреломления.

Стадия созревания споры сопровождается её уплотнением и снижением метаболической активности клетки. Споры могут располагаться центрально, субтерминально или терминально (рис. 4 – 14). У видов Bacillus диаметр споры не превышает ширины клетки, тогда как у многих видов Clostridium — значительно превышает. В ряде случаев клетка приобретает весьма характерный вид, нередко являющийся диагностическим признаком. Например, терминально расположенные споры у возбудителя столбняка придают бактериям вид «теннисных ракеток».

Ы ВЁРСТКА. Рисунок 4–14

Рис. 4 – 14. Расположение спор у бактерий.