Бактериологическая лаборатория

Введение

Подобно общей части любой другой науки, общая бактериология рассматривает не конкретные вопросы (скажем, идентификацию отдельных видов бактерий), а проблемы в це­лом; ее методология охватывает основные процедуры, которые находят широкое применение в самых разнооб­разных лабораторных исследованиях. Данное учебно-методи­че­ское пособие не нацелено на идентификацию какой-либо группы микроорганизмов. Это задача следующих изданий – по частной и санитарной микробиологии. Однако методы, приведенные в нем, могут быть полезными в любой области, где приходится иметь дело с бактериями, и могут применяться для ре­шения практических задач, включающих выделение и типизацию бактерий.

Бактериология стала наукой только после того, как были разработаны уникальные методы, благодаря кото­рым она продолжает оказывать влияние и проникать в такие появившиеся позднее области науки, как вирусо­логия, иммунология и молекулярная биология. Разрабо­танная Р. Кохом техника использования чистых культур и впервые примененные Л. Пастером иммунологические ре­акции и химический анализ и сейчас не утратили своего значения.

Методология общей бактериологии отражена в данном издании с помощью такого построения, которое типично для стандартных учебных пособий по этой дис­циплине. Однако, в отличие от лабораторных практикумов по курсу микробиологии для вузов, она по некоторым разделам изложена более детально и носит справочный характер. Данная структура учитывает особенность подготовки и специализации врачей-бактериологов и ветсанэкспертов. Часто материал излагается произвольно, поэтому некоторые методы упо­минаются несколько раз, что обусловлено стремлением продемонстрировать их взаимосвязь.

Бактериологическая лаборатория

Бактериологические лаборатории как структурные единицы организуются в составе областных, районных, межрайонных ветеринарных лабораториях, а также в структуре зональных ветеринарных лабораторий. Они также организованы при центрах санитарно-эпидемио­логиче­ского надзора, в инфекционных больницах, больницах общего типа, некоторых специализированных ста­ционарах (например, в туберкулезных, ревматологических, кожно-венерологических), и в поликлиниках. Бактериологические лаборатории входят в состав специализированных научно-исследовательских учреждений. Бактериологические лаборатории постоянно используются для подтверждения или установления оценки пригодности мяса на пищевые цели по ВСЭ.

Объектами исследования в бактериологических лабо­раториях являются:

1. Выделения из организма: моча, кал, мокрота, гной, а также кровь, патологический и трупный материал.

2. Объекты внешней среды: вода, воздух, почва, смывы с предметов инвентаря, корма, технологическое сырьё получаемое от убоя сельскохозяйственных животных.

3. Продукты питания, образцы мяса и мясопродуктов, молока и молокопродуктов, которым необходимо дать оценку на пригодность для пищевых целей.

Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места

Специфика микробиологических работ требует, чтобы по­мещение, отведенное под лабораторию, было изолировано от жилых комнат, пищевых блоков и других непрофильных производственных помещений.

В состав бактериологической лаборатории входят: лабо­раторные комнаты для бактериологических исследований и подсобные помещения; автоклавная или стерилизационная для обеззараживания отработанного материала и зараженной посуды; моечная, оборудованная для мытья посуды; бактериологическая кухня – для приготовления, разлива, стерилизации и хра­нения питательных сред; виварий для содержания подопыт­ных животных; материальная для хранения запасных реакти­вов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

Перечисленные подсобные помещения как самостоятель­ные структурные единицы входят в состав крупных бактерио­логических лабораторий. В небольших лабораториях бактериологическую кухню и стерилизационную объединяют в одной комнате; специальное помещение для содержания подопытных живот­ных отсутствует.

Помещения микробиологических лабораторий по степени опасности для персонала разделяются на 2 зоны:

I. "Заразная" зона - помещение или группа помещений лаборатории, где осуществляются манипуляции с патогенными биологическими агентами и их хранение, персонал одет в соответствующий тип защитной одежды.

II. "Чистая" зона - помещения, где не проводят работу с биологическим материалом, персонал одет в личную одежду.

Под лабораторные комнаты, в которых производят все бактериологические исследования, отводят наиболее светлые, просторные помещения. Стены в этих комнатах на высоту 170 см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской или покрывают кафелем. Пол застилают релином или линолеумом. Такого рода отдел­ка позволяет пользоваться при уборке помещения дезинфи­цирующими растворами.

В каждой комнате должна быть раковина с водопровод­ной подводкой и полкой для бутыли с дезинфицирующим раствором.

В одной из комнат оборудуют застекленный бокс - изолированное помещение с тамбуром (предбоксником) для выполнения работ в асептических условиях. В боксе ставят стол для посевов, табурет, над рабочим местом монтируют бактерицидные лампы. В предбокснике помещают шкаф для хранения стерильного материала. Окна и двери помещений "заразной" зоны должны быть герметичными. Имеющаяся вытяжная вентиляция из "заразной" зоны должна быть изолирована от других вентиляционных систем и оборудована фильтрами тонкой очистки воздуха.

Лабораторное помещение оборудуется столами лаборатор­ного типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок и реактивов.

Очень большое значение для работы имеет правильная организация рабочего места врача-бактериолога и лаборанта. Лабораторные столы устанавливают около окон. При размещении их нужно стремиться к тому, чтобы свет падал спереди или сбоку от работающего, лучше с левой стороны, но ни в коем случае не сзади. Желательно, чтобы комнаты для проведения анализов, особенно для микроскопирования, имели ориентацию окон на север или северо-запад, так как для работы необходим ровный рассеянный свет. Освещенность поверхности столов для работы должна быть 500 лк. Для удобства дезинфекции поверхность лабораторных столов покрывают пластиком или обивают железом. За каждым сотрудником лаборатории закрепляют отдельное рабочее место размером 150´60 см.

Все рабочие места оборудуют предметами, необходимыми для повседневной бактериологической работы, перечень которых дан в таблице 1.

Таблица 1.

Необходимые предметы для бактериологической работы

Наименование предмета	Примерное количество
1. Набор красок и реактивов для окраски
2. Стекла предметные	25—50
3. Стекла покровные	25—50
4. Стекла с лунками	5—10
5. Штатив под пробирки
6. Петля бактериальная
7. Шпатели стеклянные
8. Шпатели металлические
9. Банка с ватой
10. Пипетки, градуированные на 1, 2, 5, 10 мл	По 25 каждого объема
11. Пипетки пастеровские	25—50
12. Пинцет, ножницы, скальпель	По 1
13. Емкости с дезинфицирующими растворами
14. Микроскоп с осветителем
15. Лупа 5^´
16. Масленка с иммерсионным маслом
17. Фильтровальная бумага	3—5 листов
18. Банка с дезинфицирующим раствором для пипеток
19. Спиртовая или газовая горелка
20. Установка для окраски препаратов
21. Песочные часы на 1 или 2 минуты	По 1
22. Груша с резиновой трубкой
23. Карандаш по стеклу
24. Банка со спиртовыми ватками
25. Необходимая стерильная посуда	-

Дезинфекция

Дезинфекцией является уничтожение микроорганизмов в объектах внешней среды.

В микробиологических лабораториях дезинфекционные ме­роприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразным материалом, сотрудники бактериологических лабо­раторий производят профилактическую дезинфекцию рук и рабочего места.

Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (кал, моча, мокрота, различного вида жидкость, кровь) перед выбрасыванием его в канализацию.

Загрязненные патологическим материалом или культурой микробов градуированные и пастеровские пипетки, стеклян­ные шпатели и металлические инструменты тотчас после их употребления опускают в стеклянные банки с дезинфицирую­щим раствором, находящиеся на столе у каждого рабочего места.

Обязательной дезинфекции подлежат также использован­ные в работе предметные и покровные стекла, так как даже в фиксированном и окрашенном мазке иногда сохраняются жизнеспособные микроорганизмы, которые могут явиться источником внутрилабораторного заражения. Не обрабатывает­ся дезинфицирующими средствами только та посуда, в кото­рой выращивались микроорганизмы. Ее складывают в метал­лические бачки или биксы, пломбируют и сдают на автоклавирование.

Выбор дезинфицирующего вещества, концентрация его раствора, соотношение между количеством дезинфицирующего вещества и обеззараживаемого материала, а также про­должительность срока дезинфекции устанавливаются в зави­симости от конкретных условий, учитывающих в первую оче­редь устойчивость обеззараживаемых микробов, степень пред­полагаемого загрязнения, состав и консистенцию материала, в котором они находятся.

Дезинфекция рук после работы с заразным материалом и при попадании его на кожу. По окончании работы с заразным материалом руки профилактически дезинфицируют. Ватный шарик или марлевую салфетку смачивают 1% раствором хлорамина, протирают сначала левую, затем правую кисть руки в такой последовательности: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространст­ва, ногтевые ложа. Таким образом, сначала обрабатывают места наименее загрязненные, затем переходят к участкам кожи, загрязненным наиболее сильно. Протирают руки в течение 2 минут двумя тампонами последовательно. При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологиче­ским материалом в первую очередь дезинфицируют загряз­ненные участки кожи. С этой целью их покрывают на 3—5 минут ватой, увлажненной 1% раствором хлорамина, затем вату сбрасывают в бачок или ведро с отработанным ма­териалом, а руки обрабатывают вторым тампоном так же, как и при профилактической дезинфекции. После обработки хлорамином руки моют теплой водой с мылом. При работе с бактериями, образующими споры, обработка рук производится 1% активированным хлорамином. При попадании на руки заразного материала экспозицию дезинфицирующего ве­щества увеличивают до 5 минут.

Стерилизация

Стерилизация, в отличие от дезинфекции, предусматривает уничтожение в стерилизуемом объекте всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными способами: паром, сухим горячим воздухом, кипячением, фильтрацией и т. д. Выбор того или иного способа стерилизации определяется качеством и свойствами микрофлоры стерилизуемого объекта.

Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования

Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутыли, матрацы и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробок на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажные колпачки.

Резиновые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют в отдельном пакете, привязанном к горлышку посуды. Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1—10 штук. Пастеровские пипетки по 3—15 шт. заворачивают в оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты, предупреждающий попадание материала в окружающую среду. При завертывании пипеток нужно соблюдать большую осторожность, чтобы не обломать запаянные концы капилляров. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

В верхнюю часть градуированных пипеток, как и в пастеровские пипетки, вставляют предохранительную вату и затем заворачивают в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2—2,5 см и длиной 50—70 см. Полоску кладут на стол, левый конец ее загибают и завертывают им кончик пипетки, затем, вращая пипетку, навертывают на нее ленту бумаги. Для того чтобы бумага не разворачивалась, противоположный конец ее закручивают или приклеивают. На бумаге надписывают объем завернутой пипетки. При наличии пеналов градуированные пипетки стерили­зуют в них.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 180°С и 160°С соответственно 1 ч и 150 минут.

б) в автоклаве при давлении 1,5 атм. в течение 60 минут, для уничтожения споровой микрофлоры – 90 минут при 2 атм.

Стерилизация шприцев. Шприцы стерилизуют в разобран­ном виде: отдельно цилиндр и поршень в 2% растворе гидрокарбоната натрия 30 минут. При работе со спороносной микро­флорой стерилизацию производят в автоклаве при 132±2°С (2 атм.) в течение 20 мин, при 126±2°С (1,5 атм.) — 30 мин. Простерилизованный шприц собирают после того, как он остынет, в цилиндр вставляют поршень, надевают иглу, пред­варительно вынув из нее мандрен. Иглу, цилиндр и поршень берут пинцетом, который стерилизуют вместе со шприцем.

Стерилизация металлических инструментов. Металличе­ские инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты и пр.) сте­рилизуют в 2% растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины и потерю остроты. Лез­вия скальпелей и ножниц перед погружением в раствор рекомен­дуется обертывать ватой.

Стерилизация бактериальных петель. Бактериальные пет­ли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, сте­рилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования.

Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную, часть пламени горелки, чтобы не про­изошло разбрызгивания сжигаемого патогенного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, затем верхнюю часть проволоки и прожигают петледержатель. Про­каливание в целом занимает 5—7 с.

Подготовка к стерилизации и стерилизация бумаги, марли и ваты. Вату, марлю, фильтровальную бумагу стерилизуют в сухожаровой печи при температуре 160°С в течение часа от момента показания термометром данной температуры или в автоклаве при давлении 1 атм. в течение 30 минут.

Перед стерилизацией бумагу и марлю нарезают кусочка­ми, а вату сворачивают в виде шариков или тампонов нуж­ной величины. После этого каждый вид материала в отдель­ности по одной или несколько штук заворачивают в плотную бумагу. При разрыве пакета стерилизованный материал следует стерилизовать повторно, так как стерильность его нарушается.

Стерилизация перчаток и других резиновых изделий. Из­делия из резины (перчатки, трубки и т. д.), загрязненные ве­гетативной формой микробов, стерилизуют кипячением в 2% растворе гидрокарбоната натрия или текучим паром в те­чение 30 минут; при загрязнении спороносной микрофло­рой—в автоклаве при давлении 1,5—2 атм. в течение 30 или 20 минут. Резиновые перчатки перед стерилизацией внутри и сна­ружи пересыпают тальком для предохранения их от склеива­ния. Между перчатками прокладывают марлю. Каждую пару перчаток завертывают отдельно в марлю и в таком виде по­мещают в биксы.

Стерилизация патогенных культур микробов. Пробирки и чашки, содержащие культуры микробов, не нужные для даль­нейшей работы, складывают в металлический бак, пломбиру­ют крышку и сдают на стерилизацию. Культуры патогенных микробов, вегетативные формы, убивают в автоклаве в течение 30 минут при давле­нии 1 атм. Сдача баков для стерилизации в автоклавную производит­ся специально выделенным лицом под расписку. Режим сте­рилизации регистрируется в специальном журнале. При уничтожении культур микробов I и II групп патогенности, а также материала, зараженного или подозрительного на заражен­ность возбудителями, отнесенными к этим группам, баки с от­работанным материалом переносят на металлических под­носах с высокими бортами в присутствии сопровождающего лица, допущенного к работе с заразным материалом.

Виды стерилизации

Стерилизация кипячением. Стерилизацию кипячением про­изводят в стерилизаторе. В стерилизатор наливают дистиллированную воду, так как водопроводная образует накипь. (Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы—в горячую воду с добавлением гидрокарбоната натрия). Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне 30-60 минут. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.

Стерилизация сухим жаром. Стерилизация сухим жаром производится в печи Пастера. Подготовленный к стерилиза­ции материал кладут на полки так, чтобы он не соприкасался со стенками. Шкаф закрывают и после этого включают обо­грев. Продолжительность стерилизации при температуре 150°С 2 ч, при 165°С – 1 ч, при 180°С – 40 мин, при 200°С – 10-15 мин (при 170°С бумага и вата желтеют, а при более высокой температуре обугливаются). Началом стерилизации считается тот момент, когда тем­пература в печи достигнет нужной высоты. По окончании срока стерилизации печь выключают, но дверцы шкафа не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование тре­щин на горячей посуде.

Стерилизация паром под давлением. Стерилизацию паром под давлением производят в автоклаве. Автоклав состоит из двух котлов, вставленных один в другой, кожуха и крышки. Наружный котел называют водопаровой камерой, внутрен­ний — стерилизационной камерой. В водопаровом котле про­исходит образование пара. Во внутренний котел помещают стерилизуемый материал. В верхней части стерилизационного котла имеются небольшие отверстия, через которые прохо­дит пар из водопаровой камеры. Крышка автоклава гермети­чески привинчивается к кожуху. Кроме перечисленных основных частей, автоклав имеет ряд деталей, регулирующих его работу: манометр, водомер­ное стекло, предохранительный клапан, выпускной, воздушный и конденсационный краны. Манометр служит для опре­деления давления, создающегося в стерилизационной камере. Нор­мальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимается за нуль, поэтому в неработающем автоклаве стрелка манометра стоит на нуле. Между показания­ми манометра и температурой имеется определенная зависи­мость (табл. 2).

Таблица 2.

Соотношения показаний манометра и температуры кипения воды

 

Показания манометра, атм.	t кипения воды,°C	Показания манометра, атм.	t кипения воды,°C
0,0	100°	0,8	117°
0,2	105°	0,9	119°
0,4	110°	1,0	121°
0,5	112°	1,5	127°
0,6	114°	2,0	134°
0,7	116°

 

Красная черта на шкале ма­нометра определяет максималь­ное рабочее давление, которое допускается в автоклаве. Пре­дохранительный клапан служит для предохранения от чрезмерно­го повышения давления. Его уста­навливают на заданное давление, то есть, давление, при котором нуж­но производить стерилизацию, при переходе стрелки манометра за черту клапан автоклава автоматически открывается и выпускает лишний пар, замедляя тем самым дальнейший подъем давления.

На боковой стенке автоклава имеется водомерное стекло, показывающее уровень воды в водопаровом котле. На трубке водомерного стекла нанесены две горизонтальные черты — нижняя и верхняя, обозначающие соответственно допускаемый нижний и верхний уровень воды в водопаровой ка­мере. Воздушный кран предназначен для удаления воздуха из стерилизационной и водопаровой камер в начале стерилиза­ции, так как воздух, являясь плохим проводником тепла, на­рушает режим стерилизации. На дне автоклава находится конденсационный кран для освобождения стерилизационной камеры от конденсата, образующегося в период нагревания стерилизуемого материала.

Правила работы с автоклавом. Перед началом работы осматривают автоклав и контрольно-измеритель­ную аппаратуру. В автоклавах с автоматическим регулированием пара на электровакуумном манометре водопаровой камеры стрелки устанавливают в соответствии с режимом стерилизации: ниж­нюю стрелку ставят на 0,1 атм. ниже, верхнюю—на 0,1 атм. выше рабочего давления, водопаровую камеру заполняют водой до верхней отметки мерного стекла. В период заполнения водой вентиль на трубе, по которой пар поступает в камеру, держат открытым для свободного выхода воздуха из котла. Стерилизационную камеру автоклава загружают стерилизуемым материалом. После этого крышку (или дверцу) автоклава закрывают, плотно закрепляя центральным затвором или болтами; чтобы избежать перекоса, болты завинчивают крест-накрест (по диаметру). Затем включают источник подогрева (электрический ток, пар), закрывая вентиль на тру­бе, соединяющей источник пара со стерилизационной камерой. С началом парообразования и создания давления в водопаровой камере производят продувку (удаление воздуха из стерилизационного котла). Способ удаления воздуха определяется конструкцией автоклава. Вначале воздух выходит отдельными порциями, затем появляется ровная непрерывная струя пара, указывающая, что из стерилизационной камеры воздух полностью вытеснен. После удаления воздуха кран закрывают, и в стерилизационной камере начинается постепенное повышение давления.

Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшают, чтобы давление в автоклаве в течение нужного времени оставалось на одном уровне. По окончании времени стерилизации подогревание прекращают. Закрывают вентиль в трубопроводе, подающем пар в стерилизационную камеру, и открывают вентиль на конденсационной (нисходящей) трубе для снижения давления пара в камере. После падения стрелки манометра до нуля медлен­но ослабляют прижимные приспособления и открывают крыш­ку автоклава.

Температура и продолжительность стерилизации опреде­ляются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен.

Контроль температуры в стерилизационной камере осуще­ствляется периодически с помощью бактериологических тестов. Биотесты изготовляются бактериологическими лабораториями ЦСЭН. В случае непрохождения данных тестов производят проверку технического состояния автоклава.

Стерилизация текучим паром. Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколь­ко небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего кон­такта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют, главным образом, питательные среды, свойства которых из­меняются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повтор­но, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеззараживания. Такой метод полу­чил название дробной стерилизации: обработку сте­рилизуемого материала текучим паром проводят по 30 минут ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стери­лизациями материал выдерживают при комнатной темпера­туре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация. Тиндализация—дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемoгo материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60—65°С в течение 5 дней или при 70— 80°C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатывае­мый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогрева­ниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Бактериальные фильтры применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзоток­синов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как сте­рилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), спо­собные задерживать бактерии.

Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3—5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: «Ф» (фильтрующие), за­держивающие взвешенные частицы, но пропускающие бакте­рии, и «СФ» (стерилизующие), более плотные, задерживаю­щие бактерии. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в ав­токлаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливаются из нитроцеллюлозы и представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.

Бактериальные фильтры разли­чаются по величине пор и обозна­чаются порядковыми номерами (табл. 3).

Таблица 3.

Бактериальные фильтры

N ^o фильтра	Средний диаметр пор, мкм
	0,3
	0,5
	0,7
	0.9
	1,2

Непосредственно перед употреб­лением мембранные фильтры сте­рилизуют кипячением. Фильтры по­мещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50— 60°С, чтобы предупредить их скру­чивание, кипятят на слабом огне в течение 30 минут, меняя 2—3 раза воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вы­нимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.

Для фильтрации жидкостей бактериальные фильтры монтируют в специальные фильтро­вальные приборы, в частности, в фильтр Зейтца.

Он состоит из 2-х частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней—опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или чистой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой находится в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации места соединения различных частей установки для создания герметичности заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной ре­зиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному нacocy. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают насос, создающий вакуум в приемном сосуде. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра.

Приготовление мазков

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности хорошо обез­жиренного предметного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического ма­териала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жид­кого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

Приготовление мазков из крови. На пред­метное стекло, ближе к одному из его концов, наносят кап­лю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно рас­пределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и оди­наковую толщину на всем протяжении.

Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр об­разующегося мазка соответствовал величине копеечной мо­неты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.

Приготовление мазка из вязкого мате­риала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.

После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.

Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени и при­ступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.

Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому ме­сту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределя­ют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпе­чатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают по­следовательно несколько раз по­верхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпе­чатков.

Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I – II групп патогенности.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти. При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4.

Таблица 4.

Вещества для химической фиксации

Фиксирующее вещество	Время фиксации, мин
Безводный метиловый спирт
Этиловый спирт 96%	10—15
Жидкость Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1)	10—15
Жидкость Карнуа (этанола 96% 60 мл, хло­роформа 30 мл, уксусной кислоты ледя­ной 10 мл)	10-15
H2O2 3% в 96% спирте (для фиксации споровых микроорганизмов)

 

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Окраска мазков

Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А.И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящей бумаги в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.

Окраска мазков красящей бумагой. На высу­шенный и фиксированный препарат наносят несколько ка­пель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2´2 см. В течение всего времени окрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется мето­дом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно сни­мают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь ма­зок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание произ­водят через фильтровальную бумагу, задерживающую части­цы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор краси­теля.

Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высу­шенные и зафиксированные, подвергают окраске. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенный промежуток времени. Чаще всего для про­стой окраски применяют спирто-водный (1:10) фуксин Пфейффера, леффлеровскую метиленовую синьку и сафранин. Эозин, как кислая краска, упо­требляется только для окраски цитоплазмы клеток и подкраски фона. Кислый фуксин совершенно непригоден для окраски бактерий.