Протеолитические свойства микроорганизмов

Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю сре­ду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные про­дукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокис­лоты.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержа­щую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели приме­няют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коа­гулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса.

Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекоменду­ют питательные среды различного состава.

Определение протеолитической активно­сти микробов

а) На желатине. Мясо-пептонный желатин разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуе­мой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, остав­ляют стоять в комнате при 20—22°С. Остальные посевы ин­кубируют в термостате при 37°С. Вместе с опытными про­бирками в термостат ставят одну или две пробирки с неза­сеянным желатином для контроля. При температуре 37°С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вы­нутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контроль­ных пробирках приступают к просмотру роста и учету изме­нений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной сре­ды. Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменения, оставляют в термостате. Наблю­дение за изменением среды ведется в течение 20 суток. В прото­коле исследования обязательно отмечают день появления признаков разжижения среды, степень и характер ее разжи­жения.

б) На молочном агаре Эйкмана. Молочный агар Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные ко­лонии. Через 24—48 ч инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка — казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды.

в) На свернутой кровяной сыворотке. Куль­туру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыво­ротки, инкубируют в термостате при 37°С. Штам­мы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

г) В бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Протеолитически активные культуры микробов расщепляют коагу­лированный яичный белок; кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются.

Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной про­теолитической активностью обладают способностью расщеп­лять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индо­ла, сероводорода, мочевины и аммиака.

При определении видов и дифференциации разновидно­стей патогенных микробов наибольшее значение имеет выяв­ление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола в культуре микроор­ганизмов

Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической аминокислоты — триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индика­торная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при темпера­туре 37°С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода

Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца по­лоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфид свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10‑й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образова­ния конечных продуктов распада происходит иногда в тече­ние длительного времени.

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов

В культуре микробов могут быть обнаружены окисли­тельно-восстановительные ферменты, связанные главным об­разом с дыхательной функцией микроорганизма.

Как известно, процесс окисления субстрата может про­исходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидрогеназ. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какого-либо од­ного вещества всегда сопровождается восстановлением (ре­дукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донатором, а то вещество, к которому он присоединяется, — акцептором.

Акцептором водорода чаще всего является кислород воз­духа, однако им могут быть также многие органические со­единения, способные легко окисляться и восстанавливаться.

С целью выявления ферментов дегидрогеназ и определения их активности в практике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет.

В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индигокармин, нейтральный красный и др.

Для выявления редуцирующих свойств микроорганизмов указан­ные красители добавляют к обычным питательным средам: мясо-пептонному бульону, мясо-пептонному агару, молоку.

Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Это свойство микро­ба использовано в микробиологической практике в качестве дифференциального признака. Бактерии брюшного тифа ре­дуцируют метиленовый синий, но не редуцируют лакмуса и не изменяют нейтрального красного в противоположность ки­шечной палочке, которая остается нейтральной в отношении метиленового синего, но восстанавливает лакмус и нейтраль­ный красный.