Цитоплазматические включения

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплаз­ме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них — отложения жира, поли-β-оксимасляной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов. Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питатель­ных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько ме­тодик окраски.

Окрашивание поли-β-оксимасляной кислоты

Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод:

1. Фиксированный нагреванием мазок на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного (вес/объем) судана черного В, приготовлен­ного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в те­чение 5—15 минут (время определяют экспериментально).

2. Краситель сливают, препарат высушивают на воз­духе, положив предметное стекло на промокательную бумагу.

3. Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом.

4. Дополнительно окрашивают препарат в течение 15—10 с 0,5%-ным (вес/объем) водным сафранином.

5. Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Включения поли-β-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет.

Окрашивание полифосфата

Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом М_n+2Р_nО_3n+1, выявляют следую­щим образом.

1. Мазок на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. Окрашивают его в течение 10—30 с в растворе метиленового синего по Леффлеру или в 1%-ном (вес/объ­ем) толуидиновом синем.

3. Отмывают краситель водопроводной водой, под­сушивают и смотрят в микроскоп.

При окраске метиленовым синим гранулы полифос­фата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы.

Окрашивание полисахаридов с использованием реак­тива Шиффа

Этим методом выявляют гликогеноподобные веще­ства.

1. Мазок суспензии на предметном стекле фиксиру­ют нагреванием.

2. На 5 минут на стекло наносят раствор перйодата [20 мл 4%-ной (вес/объем) йодной кислоты в воде, 10 мл 0,2М водного ацетата натрия и 70 мл 95%-ного этанола; защищать раствор от света!].

3. Отмывают стекло 70%-ным (объем/объем) этанолом.

4. На 5 минут наносят на предметное стекло восста­навливающий раствор, содержащий 300 мл этанола, 5 мл 2Н соляной кислоты, 10 г йодистого калия, 5 г тиосульфата натрия (пятиводного), 200 мл дистиллиро­ванной воды. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: к раствору йодистого калия и тио­сульфата натрия в дистиллированной воде сначала при­ливают этанол, а затем соляную кислоту. Смесь пере­мешивают и оставляют на некоторое время для выпаде­ния в осадок серы, после чего собирают надосадочную жидкость.

5. Отмывают стекло 70%-ным (вес/объем) этанолом.

6. Окрашивают препарат реактивом Шиффа в тече­ние 15—45 минут (точное время следует определить экспе­риментально). Реактив Шиффа готовят следующим об­разом: 2 г основного фуксина растворяют в 400 мл кипя­щей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С и фильтруют через фильтровальную бумагу. Добавляют к фильтрату 10 мл 2Н соляной кислоты и 4 г метабисульфита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Добавляют такое количе­ство 2Н соляной кислоты (10мл), чтобы при высыхании на предметном стекле реактив не давал розового налета. Реактив Шиффа хранят в темноте.

7. Несколько раз отмывают стекло раствором, со­стоящим из 2 г метабисульфита калия и 5 мл концент­рированной соляной кислоты в 500 мл дистиллирован­ной воды.

8. Отмывают препарат водопроводной водой и допол­нительно окрашивают 0,002%-ным (вес/объем) водным раствором малахитового зеленого в течение 2—5 с.

9. Отмывают препарат водопроводной водой, подсу­шивают и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы — в зеленый.

Метод окраски полисахаридов альциановым синим

Для выявления полисахаридов можно также исполь­зовать альциановый синий. Обычно применяют 1%-ный (вес/объем) раствор альцианового синего в 95%-ном (объем/объем) этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболфуксин. Последователь­ность операций такова:

1. Мазок препарата на предметном стекле фиксиру­ют нагреванием.

2. Окрашивают мазок в течение 1 минуты разведенным в 9 раз (в воде) альциановым синим, приготовленным так, как описано выше.

3. Отмывают препарат водопроводной водой и высу­шивают.

4. Дополнительно очень быстро окрашивают (не сле­дует допускать перекрашивания!) препарат карболфуксином и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают мазок на воздухе и смотрят в мик­роскоп.

Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты — в красный.

Питательные среды

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифи­цировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, отно­сительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганиз­мов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа пита­тельных сред: так называемые синтетические среды, главные состав­ные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизве­стен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за по­всеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава ти­па бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма ши­роко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В литературе опубликованы результаты количественных анали­зов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различ­ных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количе­ствах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исклю­чительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как про­цессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.

В состав сред, применяемых для выращивания бакте­рий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород, неорганиче­ские соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потреб­ность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют глав­ным образом за счет поступающей в клетку воды.

По характеру усвоения азота патогенные микроорганиз­мы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты непол­ного ферментативного переваривания белков. Строго пара­зитические виды бактерий размножаются только в присут­ствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Потребность бактерий в неорганических элементах удов­летворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH₂PO₄, K₂HPO₄ и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтож­но малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.

Наряду с перечисленными органическими и неорганиче­скими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для живот­ных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного про­исхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Потребность в питательных веществах и физических усло­виях у различных видов микробов неодинакова и этим ис­ключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие пи­тательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ - агара или желатина. Агар-агар (по малайски – желе) — про­дукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86°С, застудневает при 36—40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при тем­пературе 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них темпера­туре на плотных средах. Желатин — вещество белковой при­роды животного происхождения. В теплой воде при темпера­туре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низ­кой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Исходные продукты для приготовления пи­тательных сред. Для приготовления питательных сред используют:

· Продукты животного происхождения (мясо, рыба, ка­зеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).

· Продукты растительного происхождения (картофель и др.).

· Органические и неорганические соединения определен­ного химического состава.

Питательные среды, приготовленные из продуктов расти­тельного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в прак­тике микробиологии. Синтетические питательные среды, со­ставленные из химических соединений, используют пре­имущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.

Требования, предъявляемые к питатель­ным средам. Питательные среды должны:

· Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.

· Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.

· Иметь достаточную влажность, так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса.

· Обладать изотоничностью.

· Быть стерильными, обеспечивая тем самым возмож­ность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе отно­сятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания мно­гих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходи­мые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся электив­ные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении ос­новных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь раз­личных микроорганизмов, раньше всего будет проявлять­ся рост того вида, для которого данная среда будет электив­ной.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностиче­ские питательные среды ис­пользуют для определения видовой принадлежности иссле­дуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагности­ческие питательные среды подразделяются следующим об­разом:

· Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе бел­ковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровя­ную сыворотку и т. д.

· Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микро­бов и не усваиваются другими видами.

· Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

· Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред, пред­назначенных для выявления сахаролитических и окислитель­но-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: ней­тральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настой­ку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на нали­чие или отсутствие расщепления, окисления или восстанов­ления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначен­ных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сыворо­точного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.

Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.

Посуда. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кис­лоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками.

Мясная вода.

1. 500 г свежей говядины или телятины освобождают от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат.

2. Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 минут. Для свертывания белков дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют 20-30 минут при 120°С и сохраняют в темном месте. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержит­ся небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовле­ния обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является первичным продуктом гид­ролиза белка и состоит из смеси полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптического переваривания.

На мясокомбинатах для производства сухого пептона ис­пользуют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Жидкий пептон можно приготовить в лабораторных усло­виях путем пептического переваривания белков.

Пептон Мартена. Свиные желудки (не промытые водой) с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250 г, вода водопроводная, нагретая до 50°С, 1000 мл, соляная кислота (удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостате при 50°С. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100°С и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелоч­ной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 30 минут.

Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом мясной воды, устанавливают необходи­мую реакцию, кипятят 30 минут, фильтруют и стерилизуют при 115°С 30 минут.

Мясо можно переваривать с помощью трипсина — пере­вар Хоттингера, при этом более полно используют белки мя­са, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и сво­бодных аминокислот. При триптическом переваривании мя­са получают в 10 раз больше бульона, чем при обычном методе.

Мясной перевар Хоттингера. Мясо, освобож­денное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусоч­ками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной во­дой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45°С жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную же­лезу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°С.

В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым находится со­вершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положитель­ную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ).

1. В 1 л мяс­ной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекоменду­ется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию сре­ды и служит дополнительным источником фосфора. Уста­навливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.

2. Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доли­вают водой до первоначального объема, проверяют рН.

3. Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°С.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других мик­робов.

Мясо-пептонный агар (МПА).

1. К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара.

Агар-агар получают путем специальной обработки морских водо­рослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°C и застывает при 40—50°.

2. Кипятят, помешивая, до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным коли­чеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°С. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.

3. Проверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем авто­клаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.

4. Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15—20 минут.

5. Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.

В настоящее время бактериологические лаборатории ши­роко используют сухие питательные среды в ви­де порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах.

Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные и дифференциально-диагнос­ти­че­ские среды. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллирован­ной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред.

Для определения рН плотных питательных сред их рас­плавляют. Определяют pH с использованием pH-метров или (менее точно) с помощью индикаторной бумаги.

После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимо­сти от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содер­жащие в своем составе нативного белка и углеводов, стери­лизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С.

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого вхо­дит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложивают­ся тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией че­рез мембранные фильтры Зейтца.

Подготовленные к употреблению питательные среды про­веряют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сутки, простерилизованные теку­чим паром — 3 суток.