Метод Пью (окраска метахроматических зерен)

К 2 мл этилового спирта добавляют 0,2 г толуидиновой синьки, а затем 100 мл 5% раствора уксусной кислоты (5 мл ледяной уксусной кислоты + 95 мл воды). Раствор хорошо хранится. На фиксированный мазок наливают краску и нагревают 1—2 минуты, до появления паров. Дают остыть, смывают водой, высушивают и иссле­дуют. При микроскопии с искусственным освещением метахромазия заметна особенно резко.

Микроскопическая картина: тела палочек — синего цвета, метахроматические зерна — красновато-фиолетовые.

Модификация Саватеева.

Приготовление красящих бумажек.

0,2 г толуидиновой синьки растирают в ступке с 5,8 г кристаллической лимонной кислоты (предварительно растертой в порошок) до получения равномерной синевато-сиреневой окраски всего порошка; затем, продолжая растирать, постепенно добавляют 10 мл дистиллированной воды. Когда вся смесь растворится, прибавляют 1 мл чистого глицерина и, хорошо размешав смесь пестиком, добав­ляют еще 10 мл дистиллированной воды; содержимое выливают в чашку и смачивают им узкие полоски (5 см длиной) фильтровальной бумаги, высуши­вают их при комнатной температуре, режут и хранят в темноте.

Техника окраски. На фиксированный мазок наносят 8—10 капель воды, кладут бумажку и нагревают 1 минуту до появления паров, что повто­ряют 3—4 раза с добавлением воды. Дают мазку остыть, смывают водой бумажку с краской, сушат и исследуют.

Результат тот же, что и при оригинальном методе Пью.

Окраска по Романовскому-Гимза

Лучше применять краску фабричного изготовления. Перед самой окраской готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды нейтральной реакции (определение рН воды см. ниже).

Разведенную краску наливают в чашку, на дно которой положены кусоч­ки предметного стекла (подставка). Мазок, фиксированный химически чистым метиловым спиртом, кладут намазанной стороной вниз на поверхность слоя краски, опирая концы препарата на кусочки стекла (подставки), и остав­ляют в таком положении от 30 минут до 2 часов, в зависимости от каче­ства краски, затем промывают водой и высушивают на воздухе в вертикаль­ном положении.

Указанный способ особенно хорош для окраски спирохет, биполяров и мазков крови.

Простой способ нейтрализации дистиллированной воды. В два химических стакана (колбы) наливают по 200 мл исследуемой воды и добавляют в каждый по 1—2 капли 1% раствора нейтральрота в дистиллированной воде (индикатор). При рН воды 5,4—5,5 (кислая реакция) получается свекловично-красная (рубиновая) окраска. Тогда в один из стаканов, тщательно размешивая, прибавляют по каплям 1% раствор угле­кислой соды до получения ясной разницы в окраске по сравнению с водой в другом (контрольном) стакане. Моментом нейтрализации считается появле­ние заметного оранжевого оттенка; если через 10—30 секунд цвет не изменится до первоначального —нейтрализация считается достигнутой. Нельзя добавлять соду до получения ясно оранжевого или, тем более, желтого цвета; в таких случаях вода окажется сильно щелочной. Зная, сколько капель раствора соды пошло на усреднение 200 мл исследуемой пробы, легко подсчитать, сколько надо взять капель для нейтрализации любого количества той же порции воды. Для окраски лучше применять воду с рН 6,8 – 7,0.

Окраска капсул

Капсулы микробов состоят главным образом из полисахаридов и гликопротеидов. Капсульными можно считать те микробы, у которых капсула обнаруживается при окраске каким-либо методом на капсулы. Капсулы и слои слизи образуются некоторыми бактериями в специфических культуральных условиях. Луч­ше всего они видны во влажных препаратах, поскольку составляющие их сильно гидратированные коллоидные полимеры легко разрушаются и сокращаются в разме­рах при высушивании и фиксации. Самым простым и наиболее эффективным из трех методов окраски капсул, описанных ниже, является ме­тод Дюгида.

Метод окраски капсул по Дюгиду

1. На чистое предметное стекло петлей наносят тушь и смешивают ее с культурой. Покровное стекло помеща­ют таким образом, чтобы была накрыта лишь часть смеси.

2. Сложенной в несколько раз фильтровальной бумагой сильно прижимают покровное стекло к предметному стеклу до появления тонкого коричневатого слоя жид­кости между ними. Препарат смотрят под большим уве­личением, применяя безиммерсионные и иммерсионные объективы.

Капсулы выглядят прозрачными зонами вокруг преломляющих свет микроорганизмов на коричневато-чер­ном фоне.

Метод окраски капсул по Гиссу

1. Взятую петлей бактериальную суспензию смеши­вают с каплей нормальной лошадиной сыворотки или снятого молока на предметном стекле.

2. Высушивают мазок на воздухе и мягко фиксиру­ют его нагреванием.

3. Покрывают мазок красящим реактивом кристал­лического фиолетового (кристалический фиолетовый 0,1 г, дистиллированная вода 100 мл) и нагревают до появления пара.

4. Отмывают кристаллический фиолетовый 20%-ным (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO₄ ´ 5H₂O). Подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Капсулы выглядят бледно-голубыми, а сами микро­организмы — темно-фиолетовыми.

Метод окраски капсул по Антони

1. Высушенный на воздухе мазок окрашивают в те­чение 2 минут 1% (вес/объем) водным раствором кристаллического фиолетового.

2. Краситель отмывают 20% (вес/объем) водным раствором сульфата меди (CuSO₄ ´ 5H₂O), удаляют избы­ток последнего и подсушивают фильтровальной бумагой.

Капсулы выглядят светло-голубыми, а микроорганиз­мы — темно-фиолетовыми.

Способ Михина

Фиксированный мазок (преимущественно из крови или селезеночной пульпы) окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут при подогревании (до появления паров). Затем краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой. Лучше окрашивать старым раствором краски.

 

Микроскопическая картина: капсулы — светло-розовые, бакте­рии —темно-синие.

Способ Гисса

Тонкий мазок, зафиксированный на пламени, окрашивают раствором основного фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора краски + 19 частей дистиллированной воды) с нагреванием до отхождения паров, затем оставляют в покое на 30 секунд. После этого краску смывают большим количеством 20% водного раствора медного купороса и обсушивают без промывания водой между листами фильтровальной бумаги.

Микроскопическая картина: капсулы — голубого цвета, тела микробов —темно-красного, эритроциты — розового, плазма лейкоцитов — голубого, ядра лейкоцитов — темно-красного.

Способ Ольта

Мазок окрашивают 2—3% водным раствором сафранина в течение 1—3 минут с последующим быстрым смыванием водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением, растворяя краску в горячей воде с последующим фильтрованием. На мазок наносят каплю воды, накрывают по­кровным стеклом, а на него помещают каплю иммерсионной жидкости. Благо­даря прохождению световых лучей через слой воды усиливается разница в лучепреломлении капсулы и тела бактерии; под микроскопом отчетливо видны окрашенные капсулы.

Микроскопическая картина: капсулы — бледно-желтого, а бактерии —коричневого цвета.

Модификация способа Ольта.

После окраски сафранином (по оригиналь­ной прописи) мазок докрашивают 1% водным раствором метиленовой синьки в течение 2 минут. Быстро смывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: палочки — синие, капсулы — розовые.

Способ Ребигера

Этот простой и демонстративный способ окраски со­стоит в том, что препарат фиксируют не пламенем, а формалином, причем фиксация происходит одновременно с окраской. Для этой цели готовят сле­дующий раствор: 15—20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40% формалина, дают раствору постоять несколько часов. Затем этот насыщенный при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированный мазок указанным выше раствором в течение 15—20 секунд, быстро промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы — красновато-фио­летовые, бактерии — темно-фиолетовые.

С успехом можно окрашивать капсулы краской Романовского-Гимза. На фиксированный мазок наносят раствор краски (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) на 15—20 минут. Краску быстро смывают водой и мазок высушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: капсулы — бледно-розового цвета, бактерии — синие.

Способ Гусельниковой

Для выявления капсульных микробов в культурах предлагается следующий способ: каплю 3—4% водного раствора конгорот нанести на абсолютно обезжиренное предметное стекло, добавить к ней одну каплю исследуемой культуры, тщательно размешать и оставить на 5—7 минут; затем каплю размазать по стеклу, как при изготовлении мазка крови, высу­шить на воздухе и микроскопировать с иммерсионной системой.

Микроскопическая картина: фон — красно-розовый, капсулы —бесцветные, микроорганизмы — розовые.

Способ Кауфмана

Мазок окрашивают леффлеровской метиленовой синькой в течение 2—3 минут. Краску смывают водой и мазок погружают в 0,5% раствор азотнокислого серебра или в 0,25% водный раствор протаргола на 3—4 минуты, затем окрашивают карболовым раствором фуксина, разведенным в 20 раз, в течение 5—10 секунд, промывают в воде и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы — темно-красные, бактерии —темно-синие.

Способ Ионе

Фиксированный мазок окрашивают 2% водным раствором метилвиолета (или генцианвиолета) в течение 1—2 минут при подогревании. Краску быстро смывают небольшим количеством воды, мазок обрабатывают 2% водным раствором уксусной кислоты в течение 10 секунд, промывают в воде и высушивают.

Микроскопическая картина: капсулы — розовато-фиоле­товые, бактерии — темно-фиолетовые.

Окраска спор

При исследовании живых неокрашенных препаратов, изготовленных из старых, главным образом, агаровых культур, споры чаще всего обнаружи­ваются в виде овальных или круглых образований, резко преломляющих свет. Зрелые споры обычными растворами красок не окрашиваются. В микробной клетке споры располагаются или в центре ее (экваториально), или на конце (терминально), или ближе к концу палочки (субтерминально). Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проникновение в споры красящего вещества. После протравливания препараты окраши­вают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, после­дующим обесцвечиванием и дополнительной окраской.

Неокрашенные споры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамле­ние и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии — это эндоспора, особенно если отсут­ствует информация о теплоустойчивости.

Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благо­даря явлению, которое наблюдается во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1% KМnO₄ в 0,3н НNО₃ или 0,3н НСl). При этом оболочка споры теряет целост­ность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашивае­мая основными красителями, выпячивается наружу че­рез образовавшуюся брешь. Из-за поразительной скоротечности происходящего события (менее 20 минут пребы­вания в растворе окислителя) этот тест заслуживает названия «проверки на лопанье» (popping test). Его удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10—20 минут в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них — негативного окрашивания — по­лучают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взя­тый петлей 7% (вес/объем) водный нигрозин сме­шивают на покровном стекле с набранной петлей куль­турой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и вы­сушивают на воздухе. Покровное стекло переворачива­ют пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндо­споры выглядят, как сильно преломляющие свет сфери­ческие или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий.

Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашива­нию, но, будучи однажды окрашенными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию.

Полезным методом пози­тивного окрашивания бактериальных эндоспор является метод Дорнера.