Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

1. Образец, фиксированный нагреванием на предмет­ном стекле, высушивают на воздухе и покрывают квадратным кусочком фильтровальной бумаги или сал­фетки, подогнанным по размеру стекла.

2. Насыщают бумагу раствором карболового фуксина и выпаривают его 5-10 минут, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере испарения. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.

3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислоты и спирта в течение 1 минуты. Промы­вают водопроводной водой и подсушивают промокатель­ной бумагой.

4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 минут в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения до­бавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окраше­ны в красный цвет, а фон — в черный.

В модифицированном методе Дорнера смешивают в пробирке водную суспензию бактерий с равным объ­емом карболфуксина. Пробирки опускают на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-ный водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подверг­шейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушивания на воздухе образуется тонкий мазок. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

Метод окраски эндоспор по Шефферу–Фултону

В этом методе вместо карболового фуксина применяется 0,5%-ный (вес/объем) водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бу­магой или бумажной салфеткой, пропитанной до насы­щения красителем, и помещают на 5 минут над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой, и мазок дополнительно окрашивают 30 секунд саф­ранином, как при окраске по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают мазок промокательной бу­магой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки — в красно-коричневый.

Метод Виртца в модификации Саватеева

К насыщенному водному раствору (около 5%) малахитовой зелени добавляют 5% глицерина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и высушивают их (лучше при 50°С). Затем готовят 0,5% водный раствор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтровальной бумаги, и высушивают. Сохраняют окрашенные бумажки в закрытых банках в защищенном от солнечного света месте.

Техника окраски. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2—3 капли дистиллированной воды и накладывают полоску бумаги, окрашен­ной малахитовой зеленью. Препарат нагревают над пламенем до появления паров (3—4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении добавляется вода. После остывания препарата смывают краску с бумажкой струей водопроводной воды (30 секунд), и тотчас же на мокрую поверхность пре­парата кладут бумажку, окрашенную сафранином. Если необходимо, добавляют несколько капель воды. Через 30—40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: свободно лежащие споры — зеленовато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток — темно-зеленые, вегетативные формы микробов — красные.

Для окраски лучше брать малахитовую зелень в виде двойной соли ZnCl₂ (медно-желтые кристаллы), хуже — щавелевокислая соль (фиолетово-зеленые или ярко-зеленые кристаллы с бронзовым блеском).

Модификация Шеффер и Фултона.

1. На фиксированный в пламени мазок наливают насыщенный (5%) водный раствор малахитовой зелени на 30—60 секунд с подогреванием до появления паров (3—4 раза).

2. Краску смывают текущей водой 30—40 секунд.

3. Наливают 0,5% водный раствор сафранина приблизительно на 30 секунд.

4. Промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу.

Микроскопическая картина: споры — зеленые, вегетатив­ные формы —красные.

Способ Пешкова

Наиболее простой и демонстративный; он не требует химических протрав и дифференцировки.

Приготовленный мазок:

1) фиксируют на пламени горелки или смесью спирта и формалина,

2) окрашивают кипящей леффлеровской метиленовой синькой (над пламенем горелки) в течение 15—20 секунд,

3) смывают водой,

4) докрашивают 0,5% водным раствором нейтральрота в течение 30 секунд,

5) промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: споры — голубого или синего цвета, молодые споры — черно-синие, цитоплазма вегетативных форм — розовая, хроматиновые элементы протоплазмы окрашиваются в фиолетовый цвет.

Способ Мюллера

1. Приготовленный на предметном стекле мазок из исследуемой культуры фиксируют на пламени.

2. На мазок наливают 5% водный раствор хромовой кислоты на 1—3 минуты.

3. Промывают препарат водой и слегка просушивают.

4. Через полоску чистой фильтровальной бумаги красят карболовым раствором фуксина при нагревании (до появле­ния паров) в течение 3—4 минут.

5. Обесцвечивают 5% водным раствором серной кислоты в течение 5 секунд.

6. Промывают водой.

7. Окрашивают допол­нительно леффлеровской синькой 1—2 минуты.

8. Промывают водой и вы­сушивают через фильтровальную бумагу.

Микроскопическая картина: споры — красные, вегета­тивные формы — синие.

Способ Ауески

На приготовленный, высушенный на воздухе (нефикси­рованный) мазок наливают 1—2% водный раствор соляной кислоты и подогре­вают на пламени до появления паров (3—4 раза). Затем препарат промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3—5 минут. Потом препарат обесцвечивают 5% водным рас­твором серной кислоты в течение нескольких секунд (до бледно-розовой окра­ски), промывают водой и дополнительно окрашивают леффлеровской метиле­новой синькой или 1% водным раствором малахитовой зелени в течение 2 минут. Краску смывают водой, мазок высушивают.

Микроскопическая картина; споры — красные, вегета­тивные формы — синие (или зеленые).

Способ Клейна

1) готовят в пробирке густую эмульсию путем смыва исследуемой культуры физиологическим раствором,

2) к эмульсии прибав­ляют равное количество карболового раствора фуксина,

3) пробирку со смесью нагревают на пламени (до появления паров) в течение 5 минут,

4) из прогретой смеси приготовляют мазок, высушивают его и фиксируют,

5) обес­цвечивают 1% водным раствором серной кислоты в течение 5—10 секунд,

6) промывают водой,

7) слегка подсушивают,

8) окрашивают леффлеровской синькой в течение 1—3 минут,

9) смывают водой и мазок обсушивают.

Микроскопическая картина: споры — красные, вегета­тивные формы — синие. Недостаток способа — значительный расход краски (фуксина).

Окраска жгутиков

Хотя Кох разработал способ окраски жгутиков более чем сто лет назад, существующие в настоящее время методики не отличаются легкостью и надежностью. Поскольку толщина бактериальных жгу­тиков лежит за пределами разрешения светового микро­скопа (жгутики имеют диаметр около 10—30 нм), для того чтобы их увидеть, необходимо, так сказать, «выма­зать их дегтем и обвалять в перьях». Неподвижные бак­терии лишены жгутиков, однако известны организмы, жгутики которых «парализованы». Для обнаружения жгутиков у микробных клеток специальные прописи предусматривают применение протрав, которые способствуют осаждению на жгутиках препаратов железа или серебра —происходит искусственное на­ращивание поперечника жгутиков, и они лучше видны под микроскопом. При окраске на жгутики, ввиду их хрупкости, необходимо соблю­дать специальные предосторожности, касающиеся как самой культуры и способа изготовления мазка, так и подготовки стекол. Культура, предназна­ченная для окраски на жгутики, должна быть свежей, не старше 12—20 часов роста при соответствующей температуре на твердой среде (преимущест­венно агаровой). Материал берут самым легким прикосновением петли к сре­де. Затем петлю с материалом вводят в пробир­ку с 2—3 мл стерильной (лучше водопро­водной) воды и, держа петлю неподвижно 1—2 минуты или осторожно погружая ее 3—4 ра­за в воду, дают самим микробам посте­пенно распределиться в воде. Через 15—20 ми­нут, когда микробы равномерно распределятся в среде, платиновой петлей осторожно берут материал и наносят на подготовленное стекло. Нанесенную каплю не размазывают по стеклу, а, дав ей подсохнуть, фиксируют на пла­мени или одним из химических способов фиксации. Предметные или покровные стекла для изготовления препаратов на жгутики должны быть абсолютно чистыми. Обычно стекла для этой цели обрабатывают по способу Цетнова. Дальнейшие подробности о технике окраски на жгутики даны при описании отдельных способов.