Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь FAQ Написать работу КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Метод окраски жгутиков по ГрэюСодержание книги
Поиск на нашем сайте
Краситель желательно добавлять к остальным ингредиентам непосредственно перед использованием, конечный раствор отфильтровать.
Методика: 1. Обычные бактерии удобно выращивать на косячках агара с соответствующим содержанием питательных веществ. За 0,5 ч до взятия пробы в пробирку с косячком добавляют водный раствор пептона, в который переходят микроорганизмы, так как жидкая среда является наиболее подходящей в подобных экспериментах. Затем пробу центрифугируют, чтобы освободиться от составных элементов среды, промывают и вновь центрифугируют. Осадок осторожно (чтобы предотвратить потерю жгутиков) ресуспендируют в 10%-ном (объем/объем) водном формалине до получения слегка мутной суспензии. 2. Суспензию петлей наносят на предметное стекло, наклоняют его под углом 45° и подсушивают препарат на воздухе. 3. Фильтруют прямо на мазок раствор А и оставляют его на нем приблизительно на 6 минут. Точное время следует определить экспериментально. 4. Раствор А смывают с предметного стекла дистиллированной водой. 5. На мазок кладут кусочек промокательной бумаги и заливают на 3 минуты раствором Б. 6. Удаляют промокательную бумагу, промывают предметное стекло дистиллированной водой, осторожно подсушивают впитывающим влагу материалом и смотрят в микроскоп. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в красный цвет. Значительная доля успеха в осуществлении метода зависит от использования абсолютно чистых обезжиренных предметных стекол. Чтобы обеспечить чистоту стекол, их нагревают либо в пламени горелки Бунзена, до тех пор пока пламя по краям стекла не становится желтым (после чего стеклам дают остыть), либо в муфельной печи в течение 20 минут при 400°С (предметные стекла в печи располагают так, чтобы они не соприкасались). После охлаждения стекла используют немедленно или хранят в емкости, не содержащей пыли. Стекла также становятся очень чистыми, если их сначала протереть жидким очистителем, а затем бумажной тканью. Не рекомендуется применять для очистки стекол, на которых красят жгутики, такие очищающие агенты, как хромовая кислота или 50%-ный (объем/объем) спирт. Метод окраски жгутиков по Ляйфсону
Смешивают равные объемы растворов 1 и 2; затем два объема получившейся смеси приливают к одному объему раствора 3. В охлажденном виде полученная смесь хранится 1—2 мес. Методика: 1. Высушенный на воздухе образец готовят в соответствии с 1-м и 2-м этапами метода Грэя. 2. Восковым стеклографом очерчивают вокруг мазка прямоугольник. 3. Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя, так чтобы нисколько не вытекло за пределы восковой линии. Оставляют краситель приблизительно на 7—15 минут; оптимальное время реакции следует определить экспериментально. 4. Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка и при освещении снизу будет видно, что вся пленка сплошь покрыта осадком, краситель удаляют, заставляя «плыть» эту пленку по поверхности пущенной из-под крана струи воды. Пленку высушивают на воздухе и смотрят в микроскоп. Тела и жгутики бактерий окрашиваются в красный цвет.
Окраска жгутиков серебрением
(Клемпарская предлагает применять, во избежание осадков, протраву в виде 2,5—3% раствора танина.) Раствор аммиачного серебра (III) готовят по следующей методике: 4 г азотнокислого серебра растворяют в 80 мл дистиллированной воды; затем к нему по каплям добавляют крепкий (25%) аммиак, пока образующийся темно-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворится и останется лишь легкая опалесценция. Раствор очень стоек. Хранить в темной склянке с притертой пробкой (защищать от пыли!). Перед окраской реактив разбавляется 1:10 дистиллированной водой. Приготовление бактериальной взвеси. Как правило, жгутики в старых культурах теряются. Иногда необходимы частые систематические пересевы в течение долгого времени на жидкие среды (ежедневные пересевы на свежие среды), пока подвижность микробов не восстановится. Хорошей средой для пересевов является обыкновенный или кровяной агар, свежий, с влажной поверхностью. На границе с конденсационной водой осторожно захватывают петлей немного бактериальной массы, переносят ее в пробирку, где налито 0,1—0,2 мл 1% формалина (реактив I), легкими движениями петли распределяют микробные тела в жидкости. До окраски приготовленную эмульсию держат при 37° в течение 2 часов и более (сохраняется годами). Приготовление стекол. Рекомендуют готовить препарат только на новых, еще не бывших в употреблении, безукоризненно чистых предметных стеклах. Стекла обрабатывают (для очистки) концентрированной соляной кислотой в течение 15 минут; затем кислоту сливают, остатки ее нейтрализуют крепким аммиаком, стекла промывают дистиллированной водой и переносят в чистый винный спирт. Вынутые из спирта (пинцетом!) стекла тщательно протирают мягкой чистой тряпочкой. В чашечку или бюксу, где налито 3—4 мл дистиллированной воды, очень тонкой пипеткой вносят 1 каплю формалиновой бактериальной взвеси. Отсюда маленькой петлей наносят 5—6 отдельных капель взвеси на центральную часть предметного стекла, не касаясь петлей его поверхности и не размазывая капли. Когда капли высохнут на воздухе, приступают к их окраске. Техника окраски. 1. На препарат (используя пинцет Корнэ!) наливают протраву (реактив II) и в течение 1—2 минут подогревают до появления паров. 2. Тщательно смывают протраву дистиллированной водой (удалению протравы способствует протирание стекла вокруг мазка кусочком фильтровальной бумаги). 3. Обрабатывают препарат в течение 2—2,5 минут раствором серебра (при легком подогревании, пока на препарате не станут видны весьма слабо окрашенные в коричневый цвет округлые пятна (рассматривать на белом фоне или в проходящем свете!). Тщательно промывают мазок дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Микроскопическая картина: тела бактерий — угольно-черного цвета, жгутики — в виде тончайших волнообразно извитых нитей коричневого или янтарно-черного цвета на прозрачном или желтоватом гомогенном фоне. Если жгутики не окрасились, удаляют масло с препарата ксилолом и вторично повторяют процедуру окраски, так как жгутики обнаруживаются только при особенно интенсивной окраске. В препарате могут быть осадки или грязный фон вследствие переноса на стекло частиц агара, конденсационной воды или при употреблении плохо очищенных стекол, грязного пинцета, наконец, в том случае, если была плохо отмыта протрава. Если бактериальная эмульсия слишком густа, то бактерии в мазке будут скучены и картина флагелляции вследствие беспорядочного сплетения жгутиков будет неясна. Желательно подобрать такую концентрацию, чтобы в одном поле зрения находилось от 5 до 10 отдельно расположенных бактерий с хорошо расправленными жгутиками. Заготовляемые для хранения препараты заключают в парафиновое масло или чистый канадский бальзам под покровным стеклом, иначе они быстро обесцветятся под действием света. Несмотря на то, что окрашивание жгутиков считается одной из тонких микробиологических операций, окраска по Морозову при известной пунктуальности выполнения даже в руках начинающих дает прекрасные результаты. Способ Уварова Особенность данного способа окраски жгутиков — отсутствие в протраве танина. Техника окраски. 1. Культуру освежают двух-трехкратными пересевами на свежий агар и выращиванием при 37° в течение 15—16 часов. 2. Для приготовления эмульсии в физиологический раствор, налитый в чистую пробирку в объеме 5 мл, осторожно погружают петлю со свежей культурой для получения слабой эмульсии. Легкими круговыми вращениями пробирки между ладонями эмульсию равномерно смешивают, затем добавляют в нее одну каплю формалина. 3. Для окраски приготовляют: а) насыщенный водный раствор калийных квасцов; б) раствор: сульфаниловой кислоты 0,5 г + соляной кислоты 1,5 мл + 100 мл дистиллированной воды; в) раствор Мюра: насыщенный водный раствор калийных квасцов 25 мл + насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета - 5 мл; г) насыщенный спиртовой раствор основного фуксина. Растворы «а» и «б» смешивают в пропорции 1:2. Растворы «в» и «г» смешивают в пропорции 3:1. 4. Окраска. Пастеровской пипеткой наносят на чистое предметное стекло каплю эмульсии и подсушивают препарат в термостате; на высохший нефиксированный препарат наливают смесь растворов «а» и «б», подогревают над пламенем при слабом отхождении паров 1—2 минуты, смывают водой и слегка высушивают. Затем на препарат наливают смесь красок «в» и «г» (раствор Мюра и насыщенный спиртовой раствор основного фуксина), нагревают препарат 1—2 минуты до слабых паров, обильно промывают и высушивают. Микроскопическая картина: жгутики — яркого красно-фиолетового или розовато-фиолетового цвета, тела бактерий — густо-фиолетовые. Способ Леффлера Приготовленный препарат осторожно фиксируют на пламени горелки и обрабатывают при подогревании в течение 0,5—1 минуты протравой следующего состава: 20% водный раствор танина (100 мл) + насыщенный на холоду водный раствор сернокислого закисного аммиачного железа (50 мл) + насыщенный спиртовой раствор основного фуксина (10 мл). Препарат тщательно обмывают слабой струей воды и слегка высушивают на воздухе, затем окрашивают карболовым раствором фуксина при подогревании в течение 2—3 минут, промывают водой и высушивают. Способ Инуйе Препарат, приготовленный со всеми предосторожностями, подогревают до появления паров в течение 1—1,5 минут в леффлеровской протраве (способ Леффлера см. выше). Затем протраву смывают водой до прекращения отхождения краски и окрашивают мазок в растворе Мюра, предварительно смешанном и профильтрованном (см. способ Уварова), над пламенем в течение 1-2 минут. Препарат после окраски промывают водой. Бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый, а жгутики — в бледно-фиолетовый, красноватый цвет. Способ Бениньетти и Джино За 2—3 дня до окраски готовят следующие растворы: 1) Раствор сернокислого цинка (1г), 15г танина, 100 мл дистиллированной воды; 2) Насыщенный (при нагревании!) водный раствор квасцов; 3) Насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета. Непосредственно перед окрашиванием указанные растворы смешивают в пропорции 1: 2: 3, смесь обязательно фильтруют, затем наливают на фиксированный препарат, подогревают в течение 2—3 минут, после чего препарат тщательно промывают водой и высушивают. Микроскопическая картина: тела бактерий — темно-фиолетового цвета, жгутики — более нежной окраски. Обычно не во всех точках препарат одинаково хорошо и равномерно окрашивается. Этот способ наиболее доступен для начинающих и дает вполне удовлетворительные результаты.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2016-04-23; просмотров: 1251; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 3.15.29.248 (0.006 с.) |