Определение вирулентности микробов

Вирулентность — биологическое свойство микроба, харак­теризующее степень его патогенности в момент исследования. В отличие от патогенности вирулентность является не видо­вым, а индивидуальным признаком микроба, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезнове­ния под влиянием различных факторов внешней среды.

Для характеристики вирулентности пользуются количест­венными показателями, определяющими способность иссле­дуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулент­ности бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она оп­ределяется не только комплексом культурно-морфологиче­ских, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резистентностью микроорганизма, подверженной большим колебаниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их питания, температурой внешней среды, а также способом заражения, принятым в опыте. Поэтому при установлении ви­рулентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта.

Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболева­ния, пользуются другими видами животных: крысами, морс­кими свинками или кроликами.

Для определения вирулентности применяют молодую культуру микроба, так как старые культуры содержат боль­шое количество мертвых клеток.

Культуру микроба для заражения выращивают на мясо-пептонном агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, небезразличен для животного организма и может извращать результаты опыта. Исследуемую культуру микроба, выра­щенную на скошенном мясо-пептонном агаре, смывают изото­ническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по оптическому стандарту так, чтобы в 1 мл этого раствора содер­жалось определенное количество микробных тел. В зависимо­сти от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования количест­во микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может коле­баться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по ка­ким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культурой. Для определения минимальной летальной дозы из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разведений: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 и т.д.

Исследуемую взвесь бактерий вводят различными спосо­бами: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, под­кожно, интраназально—в зависимости от целей и задач ис­следования.

Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной культуры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микроба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости.

Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. При определении минимальной смертельной до­зы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие дан­ные:

· количество микробов, введенных в организм животного;

· способ их введения;

· масса тела зараженного животного;

· сроки гибели после заражения.

Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:

1. Минимальная смертельная доза Dlm (Dosis letalis mi­nima), т.e. наименьшая доза микробов, которая при опреде­ленном способе заражения, в определенных условиях опы­та вызывает гибель около 95% подопытных животных.

2. Наименьшая безусловно смертельная доза Dll (Dosis lerie letalis) — наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100% животных, взятых в опыт.

3. Средняя смертельная доза микробов LD ₅₀ (Dosis leta­lis 50%)—доза микробов, вызывающая гибель 50% зара­женных животных.

Показатель LD ₅₀ позволяет получить более достоверные результаты, и потому он чаще других используется в практи­ке экспериментальных исследований.

В отличие от Dlm и Dll, определявшихся непосредственно по результатам опыта, LD ₅₀ вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в котором простота расчета удачно сочетается с доста­точно высокой точностью получаемых результатов.

Определение токсигенности микробов

В патологии человека большую роль играют токсигенные микроорганизмы, к которым относятся возбудители ботулизма, столбняка, газовой анаэробной инфекции, дифтерии, а так­же некоторые штаммы бактерий дизентерии Григорьев -Шига, стафилококка и стрептококка и некоторые другие.

Экзотоксины, вырабатываемые различными представите­лями этой группы микробов, обладают резко выраженной токсичностью, высокой избирательностью действия с пораже­нием отдельных органов и тканей и способностью при парен­теральном введении в организм вызывать образование анти­тел—антитоксинов, способных нейтрализовать соответствую­щие им экзотоксины.

Продуцируемые в процессе жизнедеятельности микроба экзотоксины легко диффундируют из клетки в окружающую их питательную среду. Бульонную культуру микроба выдер­живают в термостате в течение 2—3 недель для накопления в ней токсина, затем фильтруют через бактериальный фильтр. Получаемый при этом прозрачный фильтрат содержит неразведенный токсин.

Токсигенность микробов определяют по тому же принципу, что и вирулентность. Единицами измерения токсигенности, как и вирулентности, являются минимальная смертельная до­за (Dlm) и средняя смертельная доза (LD₅₀).

Для определения Dlm и LD₅₀ фильтрат бульонной культуры разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сотни, тысячи и миллионы раз. Каж­дую дозу токсина испытывают одновременно на 6—10 жи­вотных. Для постановки проб подбирают животных, наибо­лее чувствительных к исследуемому токсину. Например, дифтерийный токсин титруют на морских свинках, столбнячный токсин—на мышах.

При учете полученных результатов в протоколе опыта от­мечают дозу введенного токсина, способ его введения, массу тела животного и время наступления его гибели после введе­ния токсина.

Литература

1. Аристовский В.М. др. Учебник медицинской микробиологии. — М: Медгиз, 1949.

2. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера М.О, — М: «Медицина», 1982.

3. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. —М.: «Медицина», 1978.

4. Методы общей бактериологии в 3-х т. — М:, «Мир», 1983.

5. Розанов Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. — М:, ГИСХИ. 1952.

6. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федоров В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. — М.: «Колос», 1995.

7. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. — М.: Медгиз, 1958.

 

Оглавление

Введение............................................................................................................................... 3

Бактериологическая лаборатория................................................................................ 3

Помещение бактериологической лаборатории и оборудование рабочего места 4

Правила работы и поведения в лаборатории....................................................... 7

Уборка лабораторного помещения..................................................................... 8

Мытье и обработка лабораторной посуды............................................................... 9

Дезинфекция...................................................................................................................... 13

Стерилизация.................................................................................................................... 14

Подготовка и стерилизация лабораторного оборудования........................... 14

Виды стерилизации.................................................................................................... 16

Микроскопические методы исследования............................................................... 21

Приготовление препаратов для микроскопирования живых микроорганизмов. 21

Приготовление мазков............................................................................................... 26

Окраска мазков............................................................................................................ 28

Простые методы окраски мазков....................................................................... 31

Окраска по Муромцеву.................................................................................... 31

Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков............................. 32

Окраска по Граму.............................................................................................. 32

Видоизменения метода окраски по Граму...................................................... 34

Окраска по Граму в модификации Хукера...................................................... 35

Окраска по Граму в модификации Берка.................................................... 36

Модификация по Синеву.................................................................................. 37

Модификация по Эткинсу................................................................................ 38

Окраска кислотоустойчивых микробов........................................................... 39

Окраска по Циль-Нильсену............................................................................. 39

Метод Труанта окрашивания на кислотоустойчивость......................... 41

Метод Гонзеля.................................................................................................. 422

Метод Бунге и Траутенрота........................................................................... 43

Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость).......................... 432

Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость)...................... 43

Способ Нейссера................................................................................................ 44

Метод Пью (окраска метахроматических зерен)...................................... 44

Окраска по Романовскому-Гимза.................................................................. 44

Окраска капсул..................................................................................................... 446

Метод окраски капсул по Дюгиду.............................................................. 446

Метод окраски капсул по Гиссу.................................................................... 46

Метод окраски капсул по Антони................................................................. 46

Способ Михина.................................................................................................. 46

Способ Гисса....................................................................................................... 46

Способ Ольта...................................................................................................... 47

Способ Ребигера................................................................................................. 47

Способ Гусельниковой..................................................................................... 48

Способ Кауфмана.............................................................................................. 48

Способ Ионе........................................................................................................ 48

Окраска спор............................................................................................................ 48

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру................................................ 49

Метод окраски эндоспор по Шефферу -Фултону................................... 510

Метод Виртца в модификации Саватеева................................................ 510

Способ Пешкова............................................................................................... 521

Способ Мюллера............................................................................................. 532

Способ Ауески.................................................................................................. 532

Способ Клейна:.................................................................................................. 52

Окраска жгутиков................................................................................................... 53

Метод окраски жгутиков по Грэю................................................................. 54

Метод окраски жгутиков по Ляйфсону........................................................ 55

Окраска жгутиков серебрением..................................................................... 56

Способ Уварова.................................................................................................. 58

Способ Леффлера............................................................................................... 58

Способ Инуйе...................................................................................................... 59

Способ Бениньетти и Джино........................................................................... 59

Цитоплазматические включения........................................................................ 59

Окрашивание поли-β-оксимасляной кислоты......................................... 610

Окрашивание полифосфата.......................................................................... 610

Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа. 620

Метод окраски полисахаридов альциановым синим.............................. 61

Питательные среды......................................................................................................... 62

Техника посева микроорганизмов.............................................................................. 69

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды.................. 71

Получение чистых культур................................................................................. 7274

Посев штрихом.................................................................................................... 74

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху) 75

Выделение чистой культуры по способу Дригальского...................... 776

Анаэростат для культивирования анаэробов............................................ 76

Методы, позволяющие изучить культуральные свойства микроорганизмов 76

Рост микробов на плотной питательной среде................................................... 76

Особенности микробного роста на жидких питательных средах................ 79

Рост на полужидкой питательной среде.............................................................. 80

Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов............................ 80

Сахаролитические свойства микроорганизмов........................................ 81

Протеолитические свойства микроорганизмов......................................... 82

Определение индола в культуре микроорганизмов................................. 83

Определение сероводорода............................................................................ 83

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов............... 84

Определение редуцирующей способности................................................. 85

Определение фермента каталазы.................................................................. 85

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам................ 85

Лабораторные животные.............................................................................................. 87

Краткие сведения о содержании, разведении, кормлении и заболеваниях лабораторных животных 88

Правила пополнения вивария новыми животными........................................... 90

Правила содержания экспериментальных животных в виварии......... 91

Уборка и дезинфекция вивария.................................................................. 9698

Личная гигиена работников питомника (вивария)................................... 97

Правила кормления лабораторных животных.......................................... 97

Заболевания лабораторных животных................................................................ 99

Подготовка животных к заражению............................................................... 10301

Фиксация, методы заражения и взятия крови у лабораторных животных 10705

Способы заражения........................................................................................ 11109

Наркоз лабораторных животных........................................................... 11209

Внутрикожный метод................................................................................. 11210

Подкожный способ заражения................................................................ 11310

Внутримышечный способ заражения................................................... 11310

Внутрибрюшинный способ заражения................................................. 11311

Внутривенное заражение кроликов....................................................... 11411

Внутривенное заражение крыс и мышей.............................................. 11412

Заражение через пищеварительный тракт.......................................... 11412

Заражение через дыхательные пути (интраназальное заражение) 11614

Заражение в переднюю камеру глаза (интраокулярный метод)... 11614

Внутримозговой метод (интрацеребральный).................................... 11714

Внутриплевральный метод...................................................................... 11815

Содержание животных под опытом...................................................... 11815

Взятие крови у лабораторных животных и ее обработка................... 11815

Умерщвление и вскрытие лабораторных животных...................................... 12219

Вскрытие животных............................................................................................ 12220

Определение вирулентности микробов.............................................................. 12522

Определение токсигенности микробов............................................................... 12724

Литература................................................................................................................. 12825

 

 

Дмитрий Аркадьевич Васильев
Сергей Николаевич Золотухин

Анатолий Анисимович Щербаков

Лидия Владимировна Карпунина

 

МЕТОДЫ ОБЩЕЙ БАКТЕРИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

 

Ульяновск, УГСХА, 2007, 130 с.

 

 

Подписано в печать 13.03.08

Формат 60х84 1/8

Усл.п.л. 14,0. Тираж 100. Заказ

Адрес издателя: 432980, г. Ульяновск, Б. Новый Венец, 1.