Окраска кислотоустойчивых микробов

Кислотоустойчивость микробов зависит не только от наличия в них значительного количества липидов (около 36%), но и от ряда других хими­ческих и физических факторов. Так, например, установлено, что при нару­шении целостности фиксированных клеток возбудителя туберкулеза путем растирания их между стеклами эти микробы теряют кислотоустойчивость.

Окраска по методу Циль-Нильсена

1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и промывают мазок водой.

2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в тече­ние 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.

3. Мазок тщательно промывают водой.

4. Споласкивают 96°спиртом.

 

5. Снова промывают водой.

6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором (1:1000) малахитовой зе­лени или метиловой зелени.

7. Краску смывают водой, препарат высу­шивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — рубиново-красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото- и спиртоустойчивых сапрофитов — синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл + 96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото- и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото- и спиртоустойчивы.

Окраска в модификации Синева.

Фильтровальную бумагу пропитывают 2% спиртовым раствором основного фуксина, сушат и нарезают на полоски. На фиксированный мазок наносят несколько капель дистиллированной воды, накладывают полоску окрашенной бумаги, нагревают до появления паров и далее обрабатывают по оригинальной прописи Циль-Нильсена.

Мирохин (1941) рекомендует при отсутствии основного фуксина окра­шивать мазки на туберкулез по видоизмененному способу Чистовича:

1. окрас­ка генцианвиолетом или метилвиолетом на анилиновой воде с подогре­ванием — 2 минуты,

2. промывание водой,

3. обесцвечивание 2-5% азотной кислотой 8—10 секунд,

4. промывание водой,

5. обесцвечивание спиртом до побледнения,

6. промывание водой,

7. докрашивание 0,1% сафранином несколько секунд,

8. промывание водой и высушивание.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — фиолетовые на красном фоне. Кислотоустойчивость того или иного микроорганизма можно определить флуоресцентным методом. У этого метода есть преимущество, заключающееся в том, что стекла с образцами, в которых подозревается при­сутствие, например, микобактерий, можно просматри­вать под объективом с увеличением 60^´, а не 100^´; следовательно, все стекло целиком можно просмотреть за короткое время.

Метод Труанта для окрашивания на кислотоустойчивость.

Реактив для флуоресцентной окраски:
Аурамин О, С141000	1,5 г
Родамин В, С1 749	0,75 г
Глицерин	75 мл
Фенол (кристаллы, расплавлен­ные при нагревании)	10 мл
Дистиллированная вода	50 мл

Оба красителя тщательно перемешивают с 25 мл воды и фено­лом. Затем добавляют оставшуюся воду и глицерин и снова пере­мешивают. Получившийся реактив для флуоресцентной окраски фильтруют через стекловату и хранят при 4°С или при комнатной температуре.

Растворитель для обесцвечивания:
Этанол 70% (объем/объем)	99,5 мл
Соляная кислота (концентрированная)	0,5 мл
Дополнительный краситель:
Марганцевокислый калий	0,5 г
Дистиллированная вода	99,5 мл

Выполнение методики:

1. Погружают фиксированный нагреванием бактериальный мазок на 15 минут в реактив для флуо­ресцентной окраски при 20—37°С.

2. Промывают мазок под слабой, падающей под уг­лом струей дистиллированной воды, пока сток не станет бесцветным.

3. На 2—3 минуты погружают мазок в обесцвечиваю­щий растворитель, затем промывают дистиллированной водой, как описано выше.

4. Погружают мазок в дополнительный краситель на 2—4 минуты.

5. Отмывают дистиллированной водой, как описано выше, и подсушивают фильтровальной бумагой.

Просматривают образцы в люминесцентный микро­скоп с использованием возбуждающего светофильтра типа BG-12 и запирающего светофильтра типа OG-1. Клетки кис­лотоустойчивых бактерий флуоресцируют желто-оран­жевым светом на темном фоне.

Для микроскопической дифференциальной диагностики туберкулезных палочек от спиртоподатливых сапрофитов существует несколько методов.

Метод Гонзеля

1. Фиксированный мазок окрашивают карболовым рас­твором фуксина при нагревании до кипения в течение 2 минут.

2. Промывают водой и высушивают.

3. Обесцвечивают смесью соляной кислоты (3 части) и абсолютного или 95° алкоголя (97 частей) в течение 10 минут.

4. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синь­ки, разбавленным водой в 2 раза.

5. Промывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные.

Метод Бунге и Траутенрота

1. Помещают препарат на 3 часа в абсолют­ный алкоголь (для извлечения жира).

2. Наносят на мазок 5% водный раствор хромовой кислоты на 15 минут.

3. Промывают водой.

4. Окрашивают при подогревании карболовым раствором фуксина.

5. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 3 минут.

6. Докрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки не менее 5 минут.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки—красные.

Окраска по Вейксельбауму (на спиртоустойчивость)

Препарат окраши­вают карболовым фуксином при подогревании до появления паров, промывают водой, а затем окрашивают насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в тече­ние 2—3 минут. Мазок обмывают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — красные на синем фоне, а кислотоустойчивые, но спиртоподатливые палочки — синие.

Если требуется проверить в уже окрашенном по Циль-Нильсену мазке обнаруженные кислотоустойчивые палочки на спиртоустойчивость, нужно: удалить с препарата кедровое масло бензином или ксилолом, докрасить мазок насыщенным спиртовым раствором метиленовой синьки в течение 2-5 минут, обмыть водой и высушить. Кислото- и спиртоустойчивые палочки сохраняют свой красный цвет, а спиртоподатливые окрасятся в синий цвет.

Окраска по Грам-Муху (на грамофильную зернистость)

1. На фиксированный мазок наливают профильтрованную смесь из 10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета и 100 мл 2% карболовой воды (смесь пригодна 3 дня) и нагревают до кипения 4—5 раз, постоянно добавляя свежий раствор краски, или же оставляют на 24-48 часов при комнатной температуре;

2. Не промывая водой, на мазок наливают раствор Люголя на 10—15 минут;

3. Промывают водой;

4. Обесцвечивают сначала 5% раствором азотной кислоты в течение минуты, затем:

5. Обесцвечивают 3% раствором соляной кислоты в точение 10 секунд

6. Обесцвечивают смесью спирта и ацетона (1:1) до полного обесцвечивания мазка (до прекращения растворения краски);

7. Дополнительно окрашивают разведенным (1:10) фуксином или 1% водным раствором сафранина в течение нескольких секунд;

8. Ополаскивают водой, высушивают.

Микроскопическая картина: на красном (коричневом) фоне — сине-фиолетовые палочки и резко ограниченные зерна.

Модификация окраски Грам—Муха

Мазок сначала окрашивают смесью из 3 частей карболового раствора фуксина с 1 частью метилвиолета по Муху (см. выше), затем продолжают окраску по оригинальной прописи.

Микроскопическая картина: палочки — красного цвета, зерна — темно-фиолетовые.

Способ Нейссера

(Используется для окраски метахроматических зерен — волютина).

Раствор А
Метиленовая синька	0,1 г
Этиловый спирт 95°	2 мл
Ледяная уксусная кислота	5 мл
Дистиллированная вода	100 мл
Раствор Б
Кристаллвиолет	1 г
Этиловый спирт 95°	10 мл
Дистиллированная вода	300 мл

Для окраски смешивают 2 части раствора А с 1 частью раствора Б.

Техника окраски. На фиксированный мазок наливают смесь растворов А и Б, через минуту краску сливают, мазок обрабатывают раствором Люголя в течение минуты, затем промывают водой и докрашивают в течение 2—3 минут раствором хризоидина (1 г краски в 300 мл дистиллированной горячей воды), промывают водой и высушивают.

Микроскопическая картина: зернистость — темно-синяя, тела бактерий —светло-желтые.