Приготовление препаратов для микроскопии живых микроорганизмов

Для исследования живых бактериальных клеток раз­работан ряд методов. При микроскопии можно использовать культуры, выращенные в жидких средах, однако для получения нужного числа бактерий они нуж­даются, как правило, в разведении стерильной средой. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь рас­твора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения. Следует помнить, что возраст культуры и физико-химические параметры среды могут быть причи­ной ненаследуемых (фенотипических) модификаций как внепротоплазматических компонентов (жгутики и кап­сулы), так и компонентов, находящихся внутри собствен­но клетки (различные включения); все эти компоненты являются важными признаками, по которым ведется идентификация. Вместе с тем специальные операции или пересевы, производимые в лаборатории, могут благо­приятствовать развитию мутантов, имеющих наследст­венно измененные по сравнению с диким типом черты строения. Изменения могут быть стабильными и неста­бильными, но очевидно, что при описании формы и структуры бактерий условия содержания культуры должны быть строго определенными, так как старение культуры и изменения состава среды могут быть причи­ной ряда морфологических изменений.

Ниже мы приводим методы, которые часто используются при исследовании живых клеток в целях идентификации.

Для приготовления влажных препаратов одну каплю пробы (около 0,05—0,1 мл) помещают на чистую обез­жиренную поверхность предметного стекла (толщиной 0,8—1,0 мм), затем накрывают ее покровным стеклом. По­следнее имеет форму квадрата со стороной 22 мм, толщина его составляет от 0,13 до 0,16 мм (номер 1 или 1¹/₂). Чтобы предотвратить конвекционные токи, смеще­ние или высыхание, зазор между покровным и предмет­ным стеклами герметично заливают васпаром (смесь равных объемов петролатума и парафинового воска), петролатумом, свечным воском (используя фитиль свечи в качестве кисточки для нанесения расплавленного вос­ка) или прозрачным лаком для ногтей.

В течение короткого промежутка времени в этих пре­паратах можно наблюдать подвижность облигатных аэробных бактерий, однако, как только кислород исто­щится, бактерии прекращают движение.

Для рассматривания влажных препаратов рекомен­дуется фазово-контрастная микроскопия, причем для по­лучения наилучших результатов следует использовать как можно более тонкую водную пленку. Кусочек промо­кательной бумаги, положенный поверх покровного стек­ла для герметизации, способствует выводу излишнего ко­личества жидкости (так что в препарате остается лишь необходимая для просмотра тонкая пленка) и подсушиванию поверхности потенциальных полей зрения. Тепло от источника света может нарушить оптималь­ные движения бактерий. Если наблюдения ведутся в те­чение длительного периода времени, рекомендуется вставлять тепловой фильтр. Поскольку белый свет может вызывать нарушение подвижности, применяют зеленый светофильтр, лучше других реализующий коррекции, да­ваемые линзами, и хорошо воспринимаемый глазом на­блюдателя. Нагревание пробы предотвращают также с помощью задерживающей оптической вставки, запол­ненной 5-сантиметровым слоем раствора Мора (50 г сульфата железа и аммония, 1,3 мл 33%-ной (объ­ем/объем) серной кислоты и 250 мл дистиллированной воды).

Поступательное перемещение бактерий за счет жгу­тиков можно наблюдать во влажных препаратах, при­меняя в большинстве случаев иммерсион­ный масляный объектив. Скорость перемещения бактерий варьирует, и медленно движущиеся организмы следует отличать от тех, которым свойственно лишь броуновское движение. Описаны некоторые неподвижные мутанты, обладающие жгутиками. Чтобы убедить­ся в том, что жгутики действительно присущи данной бактерии, а также чтобы определить их расположение (полярное, перитрихальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.

Если используется обычный конденсор и масляно-иммерсионный объектив, для улучшения контраста количе­ство света нужно уменьшить апертурной диафрагмой, а конденсор опустить. Наиболее эффективный (и наибо­лее демонстративный) способ наблюдения за подвижны­ми микроорганизмами при малом увеличении—это темнопольная микроскопия. Необходимые для нее специ­альные конденсоры доступны далеко не всем, однако вполне удовлетворительное темное поле можно получить, применив для освещения иммерсионный конденсор от фазово-контраст­ного микроскопа и расположенную на нужном месте фазовую пластинку; наблюдения при этом ведут с помощью обычных (не фазово-контраст­ных) объективов с увеличением 10^´ или 45^´. Иммерсионная жидкость на конденсор не наносится, а положение конденсора, для которого характерно самое хорошее темное поле, находится экспериментальным путем. С помощью этого ухищрения оказывается возможным увидеть под малым увеличением даже спирохеты.

Некоторым бактериям присущ особый тип поступа­тельного движения при контакте с твердой поверх­ностью, известный как «скольжение». Это относительно медленное, моментами прекращающееся, а затем возоб­новляющееся продвижение в направлении, параллельном продольной оси организма. Для скольжения характерна частая смена направлений движения и отсутствие на­ружных локомоторных органелл. Такого типа под­вижность можно предположить, если при микроскопическом обследовании (с безиммерсионными объективами большого увеличения) краев колоний обнаруживают отделенные от самого края одиночные клетки или группы клеток. Часто в первичной среде выделения скольжение не выявляется; обычно его легче обнаружить на твердых средах с небольшим количеством питательных веществ, соответствующих их содержанию в естественной для данной группы среде обитания.

Скольжение следует отличать от роения, которое вы­ражается в движении за счет жгутиков в особых усло­виях. Роение—это распространение микроорганизмов по относительно сухой поверхности, например, агара, где они движутся в виде больших протяженных островков или микроколоний. У наблюдаемых при этом скоп­лений постоянно меняются очертания — от коротких языковидных выступов и изолированных групп до пере­плетающихся полос, чередующихся с пустотами. В мес­тах этих пустот видны следы движения, часто рассматри­ваемые в качестве признака скольжения и хорошо со­храняющиеся фиксацией по Боуэну in situ. Молодые активные культуры нитевидных организмов, передвигающихся скольжением, оставляют волнообраз­ные, завитые или спиралевидные рисунки. Поступатель­ное перемещение путем скольжения происходит со ско­ростью 10—15 мкм/с.

Раздавленная капля. На предметное стекло нано­сят каплю бульонной культуры. При обильном росте микро­бов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Нанесен­ную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и, опуская, постепенно вытесняют воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования пузырьков. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой. При малом увеличении (8^´) находят край капли, отчетливо видный в затемненном поле зре­ния. По одну сторону линии (края) видно множество мель­чайших капелек конденсата, осевших на внутренней поверх­ности покровного стекла, по другую сторону линии фон равномерно серого цвета — искомая капля. Найденный край капли устанавливают в центре поля зрения микроскопа при малом увеличении и, не сдвигая препарата, переходят на более сильную (40^´ или иммерсионную) систему, слегка расширив диафрагму микроскопа.

Живые микробы, находящиеся в препарате раздавленной капли, можно изучать и в темном поле зрения. При этом методе микроскопии толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, покровных—0,2 мм. Принцип исследования микробов в темном поле зрения заключается в том, что в объектив и, следовательно, в глаз наблюдателя попадают не прямые лучи света, а отраженные исследуемым объектом. Вследствие этого неосвещенное поле зрения оста­ется совершенно темным, а микробные тела, отражающие лучи света, освещены очень ярко.

Для создания темного поля конденсор Аббе заменяют темнопольным конденсором, имеющим затемнение центральной части. При отсутствии специального берут обычный кон­денсор Аббе, развинчивают и вкладывают между его линзами кружок черной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При микроскопии препаратов в темном поле зре­ния на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю кед­рового или вазелинового масла, поверх которой очень осто­рожно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, накладывают препарат. На покровное стекло наносится вторая капля масла. Наносить масло на обе поверхности препарата необходимо для того, чтобы при микроскопии с иммерсионной системой проходящие лучи света не преломлялись.

Метод висячего агарового слоя. Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление — пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. По­кровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикре­пить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной нахо­дящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отвер­стием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покров­ное стекло.

Негативное окрашивание. Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включени­ях, таких, как сера или гранулы поли-(р)-окси­масляной кислоты, и о спорах. При его осуществлении взя­тый петлей 7%-ный (вес/объем) водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, разма­зывают смесь до образования тонкой пленки и высуши­вают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска. В приготовленных подобным образом препаратах, со­держащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне яр­ким свечением. В дальнейшем они даже могут быть ис­пользованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток. Негативно окрашенные пре­параты не следует применять для измерения длины и ширины клеток, так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, по­скольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоид­ной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки на­ходится на относительно значительном, хотя и малень­ком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.

В растворах нигрозина могут появиться посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств рас­твора.

Приготовление мазков

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности хорошо обез­жиренного предметного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического ма­териала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жид­кого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

Приготовление мазков из крови. На пред­метное стекло, ближе к одному из его концов, наносят кап­лю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно рас­пределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и оди­наковую толщину на всем протяжении.

Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр об­разующегося мазка соответствовал величине копеечной мо­неты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.

Приготовление мазка из вязкого мате­риала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.

После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.

Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени и при­ступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.

Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому ме­сту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределя­ют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпе­чатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают по­следовательно несколько раз по­верхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпе­чатков.

Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I – II групп патогенности.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти. При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4.

Таблица 4.

Вещества для химической фиксации

Фиксирующее вещество	Время фиксации, мин
Безводный метиловый спирт
Этиловый спирт 96%	10—15
Жидкость Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1)	10—15
Жидкость Карнуа (этанола 96% 60 мл, хло­роформа 30 мл, уксусной кислоты ледя­ной 10 мл)	10-15
H2O2 3% в 96% спирте (для фиксации споровых микроорганизмов)

 

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Окраска мазков

Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А.И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящей бумаги в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.

Окраска мазков красящей бумагой. На высу­шенный и фиксированный препарат наносят несколько ка­пель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2´2 см. В течение всего времени окрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется мето­дом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно сни­мают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь ма­зок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание произ­водят через фильтровальную бумагу, задерживающую части­цы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор краси­теля.

Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высу­шенные и зафиксированные, подвергают окраске. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенный промежуток времени. Чаще всего для про­стой окраски применяют спирто-водный (1:10) фуксин Пфейффера, леффлеровскую метиленовую синьку и сафранин. Эозин, как кислая краска, упо­требляется только для окраски цитоплазмы клеток и подкраски фона. Кислый фуксин совершенно непригоден для окраски бактерий.

При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает зна­чительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спирто-водными растворами красок.

Для трудно воспринимающих окраску микробов (например, возбудитель туберкулеза) или их частей (споры, жгутики и пр.) приходится применять более интенсивные (форсированные) методы окраски.

Форсировать окраску можно: а) повышением красящей способности основных красок, б) удлинением срока окраски и в) действием протрав.

Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски.

Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.

Протравами являются вещества, облегчающие проникновение краски внутрь клеток: фенол, танин, уксусная и хромовая кислоты, щелочи и др. Механизм действия протрав различен: в одних случаях протравы действуют на краски, в других—на способность клеток к восприятию окраски. Про­травами воздействуют на мазок или перед действием краски (например, при окраске жгутиков), или совместно с краской (фенол в фуксине Циля), или же после действия краски (люголевский раствор в методе Грама).

При окраске мазков, кроме красок, применяются еще так называемые обесцвечивающие или раскрашивающие вещества. Последние служат для удаления излишка краски из всей микробной клетки или же из ее части при слишком энергичной адсорбции краски материалом или при перекра­шивании его с применением нагревания и т. п.

В качестве обесцвечивающих веществ применяются: спирт, 5% водный раствор серной кислоты, 20—30% водный раствор азотной кислоты, 3% рас­твор соляной кислоты в абсолютном алкоголе и др.

Для окраски мазков необходимо иметь на рабочем столе набор крася­щих растворов во флаконах (лучше оранжевого стекла) с пипетками и рези­новыми баллончиками. Флаконы должны быть снабжены этикетками с соответствующими обозначениями; во избежание быстрого загрязнения красками этикетки рекомендуется пропитывать расплавленным парафином (при помощи кисточки). Флаконы с красками помещают в деревянный штатив - колодку (рис. 2).

Рис. 2. Флаконы для красок

Для смывания красок и ополаскивания мазков необходимы бутыль с тубусом на подставке для дистиллированной воды и кристаллиза­тор (сливная чашка) с подставкой-мостиком для мазков. Подставка-мостик представляет собой две стеклянные трубки или палочки, соединенные на концах отрезками резиновых трубок. Ши­рина подставки должна быть меньше длины предметного стекла. Кроме того, для окраски мазков необходимы спиртовая (или газовая) горелка и пинцет Корнэ для предмет­ных стекол. При окраске с подогреванием пред­метное стекло захватывают пинцетом и выдер­живают определенное время над пламенем. При продолжительной окраске употребляют кюветки или небольшие стаканчики, куда наливают крас­ку и погружают в нее мазок. При одновремен­ной окраске в кюветке нескольких мазков, для того, чтобы стекла не слипались, их соединяют по два намазанной стороной наружу и укреп­ляют резиновыми кольцами, нарезанными из трубок. После окраски мазки промывают водой и тщательно высушивают фильтровальной бу­магой.

Работами последних лет выявлена возможность со­хранения при окраске жизнеспособности микробов, главным образом, спороносных. Поэтому необходима достаточная фиксация мазков. Про­мывные воды (при окрасках) нужно сливать в специальный сосуд с последующим обезврежи­ванием, отработанную фильтровальную бумагу (после просушки мазков) не выбрасывать, а сжигать, использованные мазки дезинфицировать.