Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фазово-контрастный, темнопольный).

Биологический микроскоп. В микробиологической практике широко применяют микроскопы отечественного производства. Предельная разрешающая способность иммерсионного микроскопа равна 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра.

Фазово-контрастная микроскопия основана на превращении изменения по фазе, возникающего при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом.

С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные и прозрачные объекты, становятся видимыми в микроскоп. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия основана на явлении фотолюминесценции.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта; вторичная (наведенная) люминесценция возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами.

Электронная микроскопия делает возможным наблюдение объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

 

Методические указания

 

Правила работы с микроскопом. Работа с микроскопом состоит из правильной установки освещенности поля зрения и препарата, и его микроскопии разными объективами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным. Для искусственного освещения используют специальные источники света, например, осветитель ОИ-7.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует:

1) на приготовленный и окрашенный мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла и поместить препарат на предметный столик (укреплять зажимами не обязательно);

2) повернуть револьвер и установить иммерсионный объектив 90, осторожно опустить тубус микроскопа вниз до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла;

3) установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта; нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, которое может повлечь поломку препарата или фронтальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

Окончательную фокусировку препарата производят микрометрическим винтом, которые рекомендуется вращать не более чем в пределах одного оборота.

После окончания работы микроскоп необходимо привести в порядок. Специальный тряпочкой тщательно вытирают масло с иммерсионного объектива, переводят револьвер на малый сухой объектив 8.

Порядок работы с фазово-контрастным устройством:

1. Установить в микроскопе фазовый конденсор и необходимый фазовый объектив. Револьвер конденсора поставить в положение «0».

2. Поместить препарат на предметный столик.

3. Установить освещение, чтобы четкое изображение нити электролампы находилось в плоскости, полностью открытой ирис-диафрагмы конденсора.

4. Заменить окуляр на вспомогательный микроскоп МИР-4 и перемещением его окуляра сфокусировать фазовое кольцо объектива до получения четкого темно-серого изображения.

5. Установить диафрагму в соответствии с фазовым объективом. В поле зрения появляется светлое кольцо диафрагмы.

6. С помощью центрировочных винтов конденсора полностью совместить светлое и темное кольца.

7. Заменить вспомогательный микроскоп окуляром и микроскопировать препарат.

8. При смене объектива или препарата вновь проверить центрировку кольцевой диафрагмы с фазовым кольцом.

Правильное выполнение всех условий обеспечивает достаточно высокую контрастность изображения.

Техника темнопольной микроскопии:

1. Заменить обычный конденсор в микроскопе на темнопольный (параболоид- или кардиоид-конденсор).

2. Для создания оптически гомогенной среды на верхнюю линзу темнопольного конденсора нанести каплю иммерсионного масла. Поднять конденсор до соприкосновения капли масла с предметным стеклом.

3. Установить достаточно сильный и стабильный источник света (например, осветитель ОИ-7) и провести точную юстировку осветительной системы микроскопа.

Возможные ошибки при микроскопии в темном поле связаны с наличием пузырьков воздуха между конденсором и предметным стеклом, неправильной установкой конденсора и другими причинами.

Техника люминесцентной микроскопии. В повседневной работе обычно пользуются освещением объекта сверху, через объектив в падающем свете. При этом используют синие светофильтры ФС-1 (2 мм) и ФС-2 (4 мм), которые устанавливают в соответствующие гнезда на правой стороне штатива микроскопа. В качестве желтого запирающего фильтра для защиты глаза используют фильтр ЖС-18, который вмонтирован в барабан, находящийся над револьвером микроскопа МЛ-2. Цифра «1» на барабане, обращенная в сторону исследователя, соответствует фильтру ЖС-18.

При работе с микроскопом МЛ-2 необходимо:

1) включить вилку блока питания микроскопа в электрическую сеть;

2) поворотом по часовой стрелке установить рукоятку регулятора напряжения у красной точки;

3) тумблер на лицевой стороне блока питания установить в положение «ВКЛ» (включено и нажать кнопку зажигания лампы микроскопа; если лампа не загорается, повернуть рукоятку регулятора напряжения на несколько миллиметров по часовой стрелке и вновь нажать кнопку (на кнопку нажимать не более 2-3 с);

4) после зажигания лампы установить рукоятку регулятора рабочего тока на отметку в 4 А; через 10 мин после включения лампы микроскопа можно начинать исследование препаратов.

При работе с опак-иллюминатором ОИ-17 следует:

1) укрепить опак-иллюминатор в тубусном гнезде головки микроскопа и сверху установить тубус;

2) отцентрировать лучи ртутно-кварцевой лампы в отношении опак-иллюминатора;

3) перед источником света поместить два синих светофильтра; для защиты глаз на окуляр надеть желтый светофильтр.

Препарат помещают на предметный столик микроскопа, револьвер с объективами устанавливают в требуемое положение и добиваются фокусировки исследуемого объекта с помощью макро- и микровинта.

Люминесцентную микроскопию проводят в затемненной комнате.

Методы приготовления препаратов для темнопольной, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии. Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии приготавливают препарат «раздавленная» капля. Микроскопируют препарат с объективом 40 или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85.

Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1,5 мм, покровных – 0,15-0,2 мм.

Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах препараты-мазки или «раздавленная» капля, которые флюорохромируют специальными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином в разведении 1:10 000 и более. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе. Приготовление и исследование препаратов в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты приготавливают на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей, наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, и изучают в электронном микроскопе.

 

Контрольные вопросы

 

1. Принципы организации и режим работы бактериологической лаборатории. Какое оборудование используют в лаборатории?

2. Назначение автоклава, сушильного шкафа, термостата, центрифуги.

3. Правила работы с биологическим микроскопом. Как следует производить установку препарата на резкость?

4. Принцип метода фазово-контрастной микроскопии. преимущества фазово-контрастной микроскопии.

5. Принцип темнопольного метода микроскопии.

6. Устройство люминесцентного микроскопа. Какие флюорохромы применяют для окраски препаратов при люминесцентной микроскопии?

7. Как устроен электронный микроскоп? Методы приготовления электронно-микроскопических препаратов бактерий и вирусов.

 

 

МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

В данной главе рассматриваются морфологические особенности основных представителей многообразного мира микроорганизмов: бактерий, актиномицетов, спирохет, микоплазм, риккетсий, грибов, вирусов животных и людей, вирусов бактерий (фагов).

 

 

Тема:«Морфология бактерий. Методы изучения микробов.

Простые способы окраски»

Цель:

– научиться различать формы бактерий при микроскопировании, готовить микропрепараты, окрашивать простыми способами.

 

Задачи:

– уметь дифференцировать различные морфологические формы бактерий;

– овладеть навыками приготовления микропрепаратов и окраски простыми методами.