Морфология и структура бактерий

 

Программ трех занятий

 

1. Формы бактерий и методы их изучения.

2. Ультраструктура бактериальных клеток.

3. Простые и сложный методы окраски.

 

Бактерии – одноклеточные организмы, которые относятся по современной классификации Берджи (1976) к разным семействам. Они имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны три основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная) и извитая.

Морфологию микроорганизмов изучают в живом виде и окрашенных препаратах.

Микропрепараты готовят из патологического материала или чистой культуры бактерий, делая мазки на предметных стеклах с использованием бактериальной петли.

Этапы приготовления микропрепаратов из культуры микробов:

1) обезжирить предметное стекло (мылом или смесью Никифорова);

2) прокалить бактериальную петлю и нанести на стекло 2-3 капли физиологического раствора;

3) прокалить бактериальную петлю, обжечь край пробирки с культурой микроба, взять касательным движением петли микроорганизм из питательной среды;

4) внести микроб в физиологический раствор и равномерно распределить в нем;

5) высушить мазок на воздухе;

6) зафиксировать мазок на огне или в смеси Никифорова.

При микроскопическом методе исследования используется окраска микропрепарата. Способность мазка воспринимать краситель называется тинкториальным свойством.

Для окраски препарата в микробиологической практике используются как основные, так и кислые красители. Из основных красителей наиболее часто применяются: нейтральный красный, сафранин, фуксин (красные); генцианвиолет, метилвиолет, кристаллвиолет (фиолетовый); метиленовый синий; малахитовый зеленый, а также везувин, хризоидин (коричневые). Из кислых красителей широкое применение находят: кислый фуксин, эозин (красные), конго, пикриновая кислота (желтые), нигрозин (черный).

 

В бактериологии различают следующие способы окраски (рис. 1).

Способы окраски

 

 

При простом методе используется одно окрашивающее ве­щество (фуксин, метиленовая синька и др.) с экспозицией 1-2 минуты. После окрашивания краситель сливают, препарат про­мывают и высушивают. Окраска простым способом позволяет выявить наличие или отсутствие микроорганизма, его форму, расположение клеток, определить размеры.

Сложные методы окраски выявляют химические и струк­турные особенности микроорганизмов, при этом обычно после­довательно применяют несколько красителей.

Одним из самых распространенных сложных методов яв­ляется окраска микробов по Граму. Этот метод был введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Кристианом Грамом и является важным таксономическим признаком. Все бактерии по способности окрашиваться красителями трифенилметанового ряда в сочетании с йодом делятся на две большие группы.

К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый генциановым фиолетовым и йодом, удерживается при обработке их спиртом. Такие бактерии называются грамположительными.

К другой группе относятся бактерии, не обладающие свойством удерживать комплекс и обесцвечивающиеся при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными. Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианового фио­летового с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Самостоятельная работа студента

на практическом занятии

 

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории	Прочитать и продумать «Правила работы студентов, работающих на кафедре микробиологии».
II. Приготовить и окрасить препараты из бактериальных культур	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники приготовления и окраски препаратов; приготовьте мазки-препараты из куль­тур стафилококков и кишечной палоч­ки. 2. Окрасьте приготовленные мазки про­стым способом – водным фуксином и метиленовой синью; ознакомьтесь с наиболее употребительными краска­ми, применяемыми в микробиологической практике.
III. Микроскопировать и зарисовать окрашен-­ ные мазки-препараты различ­ных форм бактерий	1. Прочитайте «Правила употребления иммерсионной системы»; внимательно проследите за демонстрацией препо­давателем техники микроскопии пре­паратов с помощью иммерсионной си­стемы; самостоятельно промикроскопируйте один из препаратов, проверяя каждый из этапов работы.   2. Промикроскопируйте и зарисуйте мазки-препараты различных форм бактерий: круглые (стафилококк, сарцина, стрептококк), извитые (вибрион, спирилла).
IV. Сдать преподава­телю выполненную работу	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Тема:«Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски. Обнаружение капсулы и оболочки, спор у бактерий»

Цель:

– научиться различать отдельные структурные элементы

бактерий с использованием сложных методов окраски.

 

Задачи:

– овладеть навыками сложных методов окраски;

– уметь обнаруживать структурные элементы бактерий при

микроскопировании.

 

Ультраструктура бактерий изучается с помощью электрон­но-микроскопических и микрохимических исследований. К обя­зательным структурным элементам бактерий относится оболоч­ка, цитоплазма, ядерное вещество (нуклеоид), к необязатель­ным – споры, жгутики, капсула, различные включения.

У грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый слой, у грамотрицательных – липополисахаридный. Под влиянием некоторых факторов (лизоцим, антибиотики, УФЛ и др.) происходит растворение клеточной стенки: частичное (сферопласты) или полное (протопласты). Клеточная стенка определяет форму клетки и обладает прочностью, ригидностью, регулирует осмотическое давление и аэрацию, выполняет трофи­ческую функцию. Цитоплазматическая мембрана прилегает к внутренней поверхности стенки клетки и состоит из трех слоев: липидного, протеинового и полисахаридного. Цитоплазматиче­ская мембрана выполняет функцию разделительной перегородки.

Нуклеоид содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, локализован в центральной части клетки.

Для обнаружения нуклеоида используют микрохимическую реакцию Фельгена с применением слабокислотного гидролиза. При этом освобождающаяся дезоксирибоза переходит в альдегиды, вступающие в реакцию с бесцветной фуксинсернистой кислотой специального реактива Шиффа. При этом нуклеоид окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Ядерную субстанцию можно выявить при электронно-микроскопических исследованиях ультратонких срезов бактерий.

Обнаруживаются споры при окраске по методу Циля-Нильсена.

Методика окраски по Граму

На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают кар­боловый раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты. Снимают бумагу и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту, обесцвечивая препарат в 96%-ном спирте в течение 30 секунд. Промывают водой. Красят 1-2 минуты вод­ным раствором фуксина. Ополаскивают водой и высушивают. В ре­зультате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

 

Техника окраски:

1. Фиксированный мазок покрывают полоской бумаги, на нее наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогре­вают над пламенем горелки до появления паров, каждый раз подливая краситель.

2. Бумагу снимают и обесцвечивают мазок в 5%-ном рас­творе серной кислоты, затем промывают водой.

3. На мазок наливают раствор метиленового синего на 3-5 минут.

4. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсионной системой.