Учёт успеваемости и посещаемости

ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Основы техники
бактериологических исследований

учебное пособие для студентов лечебного, педиатрического, стоматологического, фармацевтического

и медико-биологического факультетов

 

Волгоград, 2013

УДК 576.8/616 – 097(076.5)

ББК 28.4

 

 

Основы техники бактериологических исследований: учебное пособие / Сост. проф., д.м.н. В.С. Крамарь; доц., д.м.н. Т.Н. Савченко; доц., к.м.н. Л.В. Михайлова; к.б.н., асс. А.К. Рябинин; к.м.н., асс. Г.А. Четвертнова; ст. препод. Л.А. Блинцова. – Волгоградский государственный медуниверситет. - Волгоград, 2013, 160 с.

Под редакцией д.м.н., профессора О.Г. Крамарь.

 

В настоящее руководство включены методические разработки к проведению практических занятий для студентов 2-го курса всех факультетов, выполненные преподавателями кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии Волгоградского государственного медицинс­кого университета.

Методическим указаниям в каждой теме предпослан краткий теоретический материал, излагающий на современном уровне основные положения определенной проблемы. Большое внимание в методических разработках уделено профилизации проведения практических занятий для студентов различных факультетов: лечебного, педиатрического, стоматологического, фармацевтического и медико-биологи­ческого. В каждую тему включено подробное описание последовательности выполнения практических работ, вопросы для самоподготовки, и доведена необходимая литература.

 

 

Рецензенты: зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммуно­логии Саратовского государственного медицинского университета, д.м.н., профессор Г.М. Шуб; зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммуно­логии Ростовского государственного медицинского университета, д.м.н., профессор Л.И. Васильева.

 

Рекомендуется Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацев­тичес­кому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся в медицинских ВУЗах (УМО-198 от 08.04.09).

 

© Волгоградский государственный
медицинский университет, 2013

Учёт успеваемости и посещаемости

 

Студента___________________________курса__________

Факультета____________________________группы_____

 

Тема итогового занятия	Дата	Оценка	Подпись	Практичес­кие навыки	Подпись
Весенний семестр
I
II
III
Осенний семестр
I
II
УИРС	Пропуски и отработки
Рефераты	Самосто­­я­тельная исслед. работа	Практи­ческие занятия	Лекции
Тема	Оценка

 

Тематический план проведения занятий

По разделу «Общая микробиология»

№	Тема занятия
1.	Микробиологическая лаборатория и основы микробиологической техники.
2.	Классификация патогенных микробов. Морфология бактерий. Анатомия бактерий и химический состав структурных элементов бактериальных клеток.
3.	Морфология прочих прокариот и эукариот.
4.	Метаболизм и культивирование микробов.
5.	Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. Биохимическая идентификация бактерий.
6.	Распространение микробов в природе.
7.	Воздействие физических, химических и биологических факторов на микробы.
8.	Инфекция.
9.	Генетика микроорганизмов.

Часть I

МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Тема:«Микробиологические лаборатории, их оборудование. Правила техники безопасности при работе с газом, живыми микробами. Микроскопический метод исследо­вания»

Цель:

– изучить правила ра­боты в учебной мик­робиологической лаборатории, научиться пользоваться оборудованием;

– научиться микроскопировать препараты.

 

Задачи:

– овладеть основными навыками работы в микробио­логической лаборатории;

– освоить микроскопический метод исследования.

 

Устройство и требования, предъявляемые к работе

Устройство микробиологической лаборатории

 

Лаборатория должна располагаться в отдельном здании или в изолированной его части и иметь не менее 2-х входов.

Все помещения лаборатории делят на «чистую» и «заразную» зону.

- Лаборатория должна быть обеспечена водопроводом, канализацией, электричеством, приточно-вытяжной вентиляцией, центральным отоплением, горячи водоснабжением.

Таблица 1

Уровень опасности работ с микробами и категории лабораторий

Группа риска	Классификация лабора­тории	Пример лаборатории	Пример микроба, с кото­рым ведутся работы
1. Низкий индиви-дуаль­ный и низкий общественный риск	Базовые (основные)	Базовые (основные) учеб­ные лаборатории меди­цинских вузов	Кишечная палочка, эпидермальный ста-филококк
2. Умеренный инди-виду­альный и ограни-чен­ный общественный риск	Базовые (основные) с защитными устрой­ствами и средствами	Лаборатории службы здравоохранения пер­вичного звена, боль- ницы первичного звена, диа­гностические лаборатории	Сальмонеллы, вирус гепатита В, микобактерии туберкулеза*, вирус лимфоцитарного хориоменингита**
3. Высокий индивиду­альный и низкий об­щественный риск	Режимные (изолиро­ванные) или лабора­тории удержания	Специальные диагности­ческие лаборатории	Бруцеллы, вирус Ласса, гистоплазма
4. Высокий индивиду­альный и высокий об­щественный	Особого режима (мак­симально изолирован­ные) или лаборатории максимального удер­жания	Лаборатории особо опас­ных инфекций	Иерсинии чумы, вирусы Эбола и Марбург

 

* В случае больших объемов материала и высоких концентрации микробов в лаборатории или когда используемая техника может привести к образованию аэрозоля, эти и подобные им микробы должны быть отнесены к 3-й группе риска.

** Пример включает также исследовательские лаборатории при соответствующем уровне группы риска.

- В лаборатории должны быть оборудованы раковины для мытья рук персонала и раковины, предназначенные для мытья инвентаря. Высушивание рук производится электрополотенцем или индивидуальными полотенцами.

- Окна должны быть с легко открываемыми форточками и оборудованы мелкими сетками.

- Все помещения лаборатории должны иметь естественное и искусственное освещение.

- Стены лаборатории должны быть облицованы глазурной плиткой на высоту 1,5 м или выкрашены масляной краской светлых тонов.

- Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов.

- Столы, на которых производится микроскопирование, должны быть оснащены специальными настольными лампами дневного света. Рабочие поверхности столов изготавливаются из водонепроницаемого, кислото- и щелочеустойчивого материала, непроницаемого, не портящегося при обработке дезинфицирующими растворами.

- Мебель лаборатории не должна иметь щелей и пазов, затрудняющих обработку обеззараживающими веществами.

- В коридорах или на хорошо доступных местах должны быть размещены щиты с набором противопожарного инвентаря.

- В лаборатории должна быть аптечка с необходимым набором средств для оказания первой помощи.

- Помещения лаборатории должны быть распланированы таким образом, чтобы соблюдалась поточность (этапность) технологическою процесса.

- Регистратура и помещение для приема проб размещается при входе в лабораторию.

- Исследуемый материал в лабораторию доставляется в специальном металлическом футляре, биксе и т.п. Распаковка материала, присланного в лабораторию для исследования, проводится лаборантом с соблюдением мер предосторожности. Банки и пробирки, содержащие материал, обтирают дезинфицирующим раствором и ставят в металлические подносы и штативы.

- Бикс, в котором доставляется материал, обрабатывают внутри дезинфицирующим раствором. Только после этого в него можно положить чистую посуду, требуемую в отделении.

 

Требования к работе с микроорганизмами I и IV групп патогенности

Работу с культурами микробов I и II групп можно проводить только с разрешения Центральной режимной комиссии Главного управления карантинных инфекций Министерства Здравоохранения РФ.

Работа с возбудителями III и IV групп требует соблюдения обычного режима работы лаборатории, обеспечивающего надежную защиту персонала лаборатории от внутри лабораторных заражений в процессе исследований и надлежащее обеззараживание материала, исключающее возможность распространения возбудителей за пределы лаборатории. Лаборатории, производящие работы с микроорганизмами III и IV группы патогенности должны располагаться в отдельно стоящих зданиях, не связанных с производственными помещениями, или в изолированном блоке здания, имеющем отдельный вход, а лаборатории, работающие с микроорганизмами IV группы патогенности, могут располагаться в изолированном блоке производственного корпуса.

Требования, предъявляемые к работе в бактериологической

Лаборатории

- Доставка в лабораторию материала проводится в контейнерах, биксах или в сумках-холодильниках.

- Во время работ с патологическим материалом, которые проводят в боксах и предбоксниках, двери должны быть закрыты, выход из бокса во время работы запрещен.

- После окончания работы все объекты, содержащие патогенные биологические агенты (ПБА), убираются в холодильники, термостаты, шкафы.

- Слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть запрещен.

- Посуда со сгустками крови подлежит обеззараживанию дезинфицирующими растворами.

- После завершения работы в «заразной» зоне все ее помещения запираются и опечатываются.

- Хранение ПБА,их учет, передача, транспортировка и уничтожение проводится в соответствии с требованиями СП 1.2.036-95.

- В одном и том же помещении допускается поочередное проведение диагностических и экспериментальных исследований после проведения дезинфекции помещения.

- В лаборатории должен храниться минимальный недельный запас дезинфицирующих средств.

- Контроль работы автоклавов проводят в соответствии с «Методическими указаниями по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов».

- Обязательно проводить текущую уборку помещений ежедневно влажным способом после окончания рабочего дня: в «чистой» зоне лаборатории с использованием моющих средств. Уборку «заразной» зоны проводят с применением дезинфектантов.

- В боксах обязательна еженедельная генеральная уборка с применением дезинфицирующих средств. После проведения влажной уборки проводят обязательную дезинфекцию с помощью бактерицидных ламп.

Методические указания

 

Правила работы с микроскопом. Работа с микроскопом состоит из правильной установки освещенности поля зрения и препарата, и его микроскопии разными объективами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным. Для искусственного освещения используют специальные источники света, например, осветитель ОИ-7.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует:

1) на приготовленный и окрашенный мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла и поместить препарат на предметный столик (укреплять зажимами не обязательно);

2) повернуть револьвер и установить иммерсионный объектив 90, осторожно опустить тубус микроскопа вниз до погружения фронтальной линзы иммерсионного объектива в каплю масла;

3) установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта; нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, которое может повлечь поломку препарата или фронтальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1 мм).

Окончательную фокусировку препарата производят микрометрическим винтом, которые рекомендуется вращать не более чем в пределах одного оборота.

После окончания работы микроскоп необходимо привести в порядок. Специальный тряпочкой тщательно вытирают масло с иммерсионного объектива, переводят револьвер на малый сухой объектив 8.

Порядок работы с фазово-контрастным устройством:

1. Установить в микроскопе фазовый конденсор и необходимый фазовый объектив. Револьвер конденсора поставить в положение «0».

2. Поместить препарат на предметный столик.

3. Установить освещение, чтобы четкое изображение нити электролампы находилось в плоскости, полностью открытой ирис-диафрагмы конденсора.

4. Заменить окуляр на вспомогательный микроскоп МИР-4 и перемещением его окуляра сфокусировать фазовое кольцо объектива до получения четкого темно-серого изображения.

5. Установить диафрагму в соответствии с фазовым объективом. В поле зрения появляется светлое кольцо диафрагмы.

6. С помощью центрировочных винтов конденсора полностью совместить светлое и темное кольца.

7. Заменить вспомогательный микроскоп окуляром и микроскопировать препарат.

8. При смене объектива или препарата вновь проверить центрировку кольцевой диафрагмы с фазовым кольцом.

Правильное выполнение всех условий обеспечивает достаточно высокую контрастность изображения.

Техника темнопольной микроскопии:

1. Заменить обычный конденсор в микроскопе на темнопольный (параболоид- или кардиоид-конденсор).

2. Для создания оптически гомогенной среды на верхнюю линзу темнопольного конденсора нанести каплю иммерсионного масла. Поднять конденсор до соприкосновения капли масла с предметным стеклом.

3. Установить достаточно сильный и стабильный источник света (например, осветитель ОИ-7) и провести точную юстировку осветительной системы микроскопа.

Возможные ошибки при микроскопии в темном поле связаны с наличием пузырьков воздуха между конденсором и предметным стеклом, неправильной установкой конденсора и другими причинами.

Техника люминесцентной микроскопии. В повседневной работе обычно пользуются освещением объекта сверху, через объектив в падающем свете. При этом используют синие светофильтры ФС-1 (2 мм) и ФС-2 (4 мм), которые устанавливают в соответствующие гнезда на правой стороне штатива микроскопа. В качестве желтого запирающего фильтра для защиты глаза используют фильтр ЖС-18, который вмонтирован в барабан, находящийся над револьвером микроскопа МЛ-2. Цифра «1» на барабане, обращенная в сторону исследователя, соответствует фильтру ЖС-18.

При работе с микроскопом МЛ-2 необходимо:

1) включить вилку блока питания микроскопа в электрическую сеть;

2) поворотом по часовой стрелке установить рукоятку регулятора напряжения у красной точки;

3) тумблер на лицевой стороне блока питания установить в положение «ВКЛ» (включено и нажать кнопку зажигания лампы микроскопа; если лампа не загорается, повернуть рукоятку регулятора напряжения на несколько миллиметров по часовой стрелке и вновь нажать кнопку (на кнопку нажимать не более 2-3 с);

4) после зажигания лампы установить рукоятку регулятора рабочего тока на отметку в 4 А; через 10 мин после включения лампы микроскопа можно начинать исследование препаратов.

При работе с опак-иллюминатором ОИ-17 следует:

1) укрепить опак-иллюминатор в тубусном гнезде головки микроскопа и сверху установить тубус;

2) отцентрировать лучи ртутно-кварцевой лампы в отношении опак-иллюминатора;

3) перед источником света поместить два синих светофильтра; для защиты глаз на окуляр надеть желтый светофильтр.

Препарат помещают на предметный столик микроскопа, револьвер с объективами устанавливают в требуемое положение и добиваются фокусировки исследуемого объекта с помощью макро- и микровинта.

Люминесцентную микроскопию проводят в затемненной комнате.

Методы приготовления препаратов для темнопольной, фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии. Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии приготавливают препарат «раздавленная» капля. Микроскопируют препарат с объективом 40 или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до 0,85.

Толщина предметных стекол не должна превышать 1-1,5 мм, покровных – 0,15-0,2 мм.

Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах препараты-мазки или «раздавленная» капля, которые флюорохромируют специальными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином в разведении 1:10 000 и более. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе. Приготовление и исследование препаратов в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты приготавливают на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей, наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, и изучают в электронном микроскопе.

 

Контрольные вопросы

 

1. Принципы организации и режим работы бактериологической лаборатории. Какое оборудование используют в лаборатории?

2. Назначение автоклава, сушильного шкафа, термостата, центрифуги.

3. Правила работы с биологическим микроскопом. Как следует производить установку препарата на резкость?

4. Принцип метода фазово-контрастной микроскопии. преимущества фазово-контрастной микроскопии.

5. Принцип темнопольного метода микроскопии.

6. Устройство люминесцентного микроскопа. Какие флюорохромы применяют для окраски препаратов при люминесцентной микроскопии?

7. Как устроен электронный микроскоп? Методы приготовления электронно-микроскопических препаратов бактерий и вирусов.

 

 

МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

В данной главе рассматриваются морфологические особенности основных представителей многообразного мира микроорганизмов: бактерий, актиномицетов, спирохет, микоплазм, риккетсий, грибов, вирусов животных и людей, вирусов бактерий (фагов).

 

 

Тема:«Морфология бактерий. Методы изучения микробов.

Простые способы окраски»

Цель:

– научиться различать формы бактерий при микроскопировании, готовить микропрепараты, окрашивать простыми способами.

 

Задачи:

– уметь дифференцировать различные морфологические формы бактерий;

– овладеть навыками приготовления микропрепаратов и окраски простыми методами.

 

Программ трех занятий

 

1. Формы бактерий и методы их изучения.

2. Ультраструктура бактериальных клеток.

3. Простые и сложный методы окраски.

 

Бактерии – одноклеточные организмы, которые относятся по современной классификации Берджи (1976) к разным семействам. Они имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны три основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная) и извитая.

Морфологию микроорганизмов изучают в живом виде и окрашенных препаратах.

Микропрепараты готовят из патологического материала или чистой культуры бактерий, делая мазки на предметных стеклах с использованием бактериальной петли.

Этапы приготовления микропрепаратов из культуры микробов:

1) обезжирить предметное стекло (мылом или смесью Никифорова);

2) прокалить бактериальную петлю и нанести на стекло 2-3 капли физиологического раствора;

3) прокалить бактериальную петлю, обжечь край пробирки с культурой микроба, взять касательным движением петли микроорганизм из питательной среды;

4) внести микроб в физиологический раствор и равномерно распределить в нем;

5) высушить мазок на воздухе;

6) зафиксировать мазок на огне или в смеси Никифорова.

При микроскопическом методе исследования используется окраска микропрепарата. Способность мазка воспринимать краситель называется тинкториальным свойством.

Для окраски препарата в микробиологической практике используются как основные, так и кислые красители. Из основных красителей наиболее часто применяются: нейтральный красный, сафранин, фуксин (красные); генцианвиолет, метилвиолет, кристаллвиолет (фиолетовый); метиленовый синий; малахитовый зеленый, а также везувин, хризоидин (коричневые). Из кислых красителей широкое применение находят: кислый фуксин, эозин (красные), конго, пикриновая кислота (желтые), нигрозин (черный).

 

В бактериологии различают следующие способы окраски (рис. 1).

Способы окраски

 

 

При простом методе используется одно окрашивающее ве­щество (фуксин, метиленовая синька и др.) с экспозицией 1-2 минуты. После окрашивания краситель сливают, препарат про­мывают и высушивают. Окраска простым способом позволяет выявить наличие или отсутствие микроорганизма, его форму, расположение клеток, определить размеры.

Сложные методы окраски выявляют химические и струк­турные особенности микроорганизмов, при этом обычно после­довательно применяют несколько красителей.

Одним из самых распространенных сложных методов яв­ляется окраска микробов по Граму. Этот метод был введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Кристианом Грамом и является важным таксономическим признаком. Все бактерии по способности окрашиваться красителями трифенилметанового ряда в сочетании с йодом делятся на две большие группы.

К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый генциановым фиолетовым и йодом, удерживается при обработке их спиртом. Такие бактерии называются грамположительными.

К другой группе относятся бактерии, не обладающие свойством удерживать комплекс и обесцвечивающиеся при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными. Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианового фио­летового с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Самостоятельная работа студента

на практическом занятии

 

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Ознакомиться с правилами работы в микробиологической лаборатории	Прочитать и продумать «Правила работы студентов, работающих на кафедре микробиологии».
II. Приготовить и окрасить препараты из бактериальных культур	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники приготовления и окраски препаратов; приготовьте мазки-препараты из куль­тур стафилококков и кишечной палоч­ки. 2. Окрасьте приготовленные мазки про­стым способом – водным фуксином и метиленовой синью; ознакомьтесь с наиболее употребительными краска­ми, применяемыми в микробиологической практике.
III. Микроскопировать и зарисовать окрашен-­ ные мазки-препараты различ­ных форм бактерий	1. Прочитайте «Правила употребления иммерсионной системы»; внимательно проследите за демонстрацией препо­давателем техники микроскопии пре­паратов с помощью иммерсионной си­стемы; самостоятельно промикроскопируйте один из препаратов, проверяя каждый из этапов работы.   2. Промикроскопируйте и зарисуйте мазки-препараты различных форм бактерий: круглые (стафилококк, сарцина, стрептококк), извитые (вибрион, спирилла).
IV. Сдать преподава­телю выполненную работу	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Тема:«Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски. Обнаружение капсулы и оболочки, спор у бактерий»

Цель:

– научиться различать отдельные структурные элементы

бактерий с использованием сложных методов окраски.

 

Задачи:

– овладеть навыками сложных методов окраски;

– уметь обнаруживать структурные элементы бактерий при

микроскопировании.

 

Ультраструктура бактерий изучается с помощью электрон­но-микроскопических и микрохимических исследований. К обя­зательным структурным элементам бактерий относится оболоч­ка, цитоплазма, ядерное вещество (нуклеоид), к необязатель­ным – споры, жгутики, капсула, различные включения.

У грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый слой, у грамотрицательных – липополисахаридный. Под влиянием некоторых факторов (лизоцим, антибиотики, УФЛ и др.) происходит растворение клеточной стенки: частичное (сферопласты) или полное (протопласты). Клеточная стенка определяет форму клетки и обладает прочностью, ригидностью, регулирует осмотическое давление и аэрацию, выполняет трофи­ческую функцию. Цитоплазматическая мембрана прилегает к внутренней поверхности стенки клетки и состоит из трех слоев: липидного, протеинового и полисахаридного. Цитоплазматиче­ская мембрана выполняет функцию разделительной перегородки.

Нуклеоид содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, локализован в центральной части клетки.

Для обнаружения нуклеоида используют микрохимическую реакцию Фельгена с применением слабокислотного гидролиза. При этом освобождающаяся дезоксирибоза переходит в альдегиды, вступающие в реакцию с бесцветной фуксинсернистой кислотой специального реактива Шиффа. При этом нуклеоид окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Ядерную субстанцию можно выявить при электронно-микроскопических исследованиях ультратонких срезов бактерий.

Обнаруживаются споры при окраске по методу Циля-Нильсена.

Методика окраски по Граму

На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают кар­боловый раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты. Снимают бумагу и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту, обесцвечивая препарат в 96%-ном спирте в течение 30 секунд. Промывают водой. Красят 1-2 минуты вод­ным раствором фуксина. Ополаскивают водой и высушивают. В ре­зультате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный.

 

Техника окраски:

1. Фиксированный мазок покрывают полоской бумаги, на нее наносят карболовый фуксин Циля и несколько раз подогре­вают над пламенем горелки до появления паров, каждый раз подливая краситель.

2. Бумагу снимают и обесцвечивают мазок в 5%-ном рас­творе серной кислоты, затем промывают водой.

3. На мазок наливают раствор метиленового синего на 3-5 минут.

4. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсионной системой.

 

 

На практическом занятии

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Изучить метод окраски по Граму	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Граму. 2. Поставьте опыт окраски по Граму. Цель опыта: определить, имеет ли метод Грама преимущество перед простым методом, и в чем оно состоит; опреде­лить, в каких случаях целесообразно применение метода окраски по Граму. Материал: стафилококки (грамположи­тельные бактерии) и кишечные палочки (грамотри-цательные бактерии). Ход опыта: приготовить три одинако­вых мазка из смеси стафилококков и кишечных палочек; окрасить один ма­зок водным фуксином, второй – генцианвиолетом, третий – по Граму. Результат: три рисунка и их описание. Вывод: (вывод содержит ответы на во­просы, поставленные в цели опыта).
II. Изучить метод окраски по Цилю-Нильсену	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Цилю-Нильсену. 2. Поставьте опыт окраски по Цилю-Нильсену. Цель опыта: определить, имеет ли метод Циля-Нильсена преимущество перед простым способом окраски, и в чем оно состоит; в каких случаях целесо­образно применение этого метода. Материал: два мазка из смеси туберку­лезной палочки (кислотоустойчивые бактерии) и кишечных палочек (кислотоподатливые бактерии). Ход опыта: окрасьте один мазок про­стым способом (метиленовой синью), второй — по Цилю-Нильсену. Результат: два рисунка и их описание. Вывод. 3. Изобразите критерии окраски по Ци­лю-Нильсену в виде схемы.
III. Сдать выполненную работу препода­вателю	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.
IV. Изучить капсулы бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте демон-страционный препарат из культу­ры палочки Фридлендера, окрашен­ный по способу Гинса; капсулы на ри­сунке укажите стрелкой.
V. Изучить споры бак­терий	Промикроскопируйте и зарисуйте мазок из культуры антракоидной палочки, окрашенной по способу Циля-Нильсена; споры на рисунке отметьте стрелкой.
VI. Изучить жгутики бактерий и подвиж-­ ность	1. Внимательно проследите за демонстра­цией преподавателем техники приго­товления и микроскопирования пре­паратов «раздав-ленной» и «висячей» капли. Приготовьте препараты из культуры подвижных бактерий. 2. Промикроскопируйте демонстрацион­ные пробирки с полужидким агаром, засеянные подвижными и неподвиж­ными микробами. Результаты зарисуйте и дайте объясне­ние их в дневник.
VII. Изучить включения бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте готовые мазки из культур дифтерийной и сенной палочек. Включения на рисунке отметьте стрел­кой и объясните в дневнике причину окраски тела и включений бактерий в разные цвета.
VIII. Изучить ультра- микроскопическую структуру бактерий	Посмотрите таблицы с электронограммами бактерий и обсудите вместе с преподавателем тонкую структуру клеточной стенки, строение цитоплазматической мембраны, включений.
IX. Сдать выполненную работу	Продемонстрируйте преподавателю приготов-ленные Вами препараты «раздавленной» и «висячей» капли, технику их микроскопии; дайте на просмотр преподавателю тетради; приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Контрольные вопросы

 

1. Перечислить основные этапы развития микробиологии и фамилии ученых, работы которых определили появление новых этапов.

2. Перечислите основные открытия Л. Пастера, Р. Коха, И.И. Мечникова.

3. Назовите отрасли микробиологии.

4. Основные разделы медицинской микробиологии.

5. Классификационные категории в микробиологии. Что та­кое бинарная номенклатура?

6. Как пишутся названия микробов (приведите примеры), группы микроорга­низмов?

7. Основные формы бактерий.

8. Как называются кокки, располагающиеся попарно? Цепоч­кой? Гроздьями? По четыре? Пакетами?

9. Как называются палочки, образующие споры? Не обра­зующие споры?

10. Как называются извитые формы с одним завитком спирали? С несколькими завитками спирали?

11. Каким будет общее увеличение микроскопа: окуляр ×10, объектив 8? Окуляр ×10, объектив 40? Окуляр ×10, объектив 90?

12. Чему равна разрешающая способность микроскопа с иммер­сионным объективом? Какова роль иммерсионного масла?

13. Перечислите структурные элементы бактериальной клетки: постоянные и непостоянные.

14. Оболочка бактерий, ее биологическая роль.

15. Какую форму принимает цитоплазма, искусственно лишен­ная оболочки?

16. Способ выявления оболочки.

17. Капсула, ее биологическая роль у патогенных бактерий.

18. Способ выявления капсулы в препаратах.

19. Перечислите патогенные бактерии, образующие капсулу.

20. Перечислите спорообразующие палочки.

21. Биологическая роль спор.

22. Процесс образования споры, условия и время, необходимые для этого процесса.

23. Процесс прорастания вегетативных форм бактерий из спор.

24. Как могут располагаться споры в теле бактерий?

25. Способ выявления спор в препаратах.

26. Включения бактерий, их биологическая роль, способ выяв­ления.

27. Биологическая роль жгутиков у бактерий. Как можно уви­деть жгутики у бактерий?

 

 

 

Часть II

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Тема:«Питание и дыхание бактерий. Питательные среды.

Выделение чистых культур аэробов и анаэробов. Бактериологический метод исследования»

Цель:

– на основании знания особенностей физиологии мик­роорганизмов

научиться проводить бактериологиче­ский метод исследования.

Задачи:

– освоить механизм питания и дыхания бактерий;

– научиться методам культивирования аэробов и анаэробов;

– овладеть основными методами микробиологи­ческой техники;

– уметь выбрать питательную среду для культиви­рования микробов

(аэробов и анаэробов);

– овладеть методами выделения чистых культур и их

идентификации.

 

Изучение физиологических и биохимических свойств мик­робов требует специальных методик исследования, в соот­ветствии с чем в данном разделе изложены основы микробиоло­гической техники, методы выделения чистых культур, идентифи­кации, методы приготовления питательных сред, методы стери­лизации и т.д.

Знание бактериологических методов исследования патоло­гического материала служит основой для изучения всех после­дующих разделов микробиологической диагностики. Прежде всего, необходимо выделить чистую культуру бактерий. Для ее получения необходимо иметь питательные среды и владеть методами выделе­ния чистой культуры.

Для культивирования микроорганизмов в баклабораториях используются искусственные питательные среды.

По химическому составу и характеру биополимеров (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) прокариотические клетки не отличаются от эукариотических. Основными химическими компонентами бактериальной клетки являются органогены (кислород, водород, углерод, азот, фосфор). Процесс, в ходе которого бактериальная клетка получает из окружающей среды компоненты, необходимые для построения ее биополимеров, называется питанием.

Метаболизм бактерий представляет собой совокупность двух противо­положных, но взаимосвязанных процессов – катаболизма и анаболизма. Катаболизм (диссимиляция) – распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ. Ана­болизм (ассимиляция) – синтез веществ с затратой энергии. Метаболизм бак­терий исследуют с помощью биохимических и физико-химических методов в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на питатель­ных средах, содержащих те или ины