Методика окраски по Нейссеру

1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 1 минуту, затем сливают краску.

2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 секунд.

3. Далее окрашивают везувином 1-3 мин.

4. Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина – в темно-синий, почти черный цвет.

 

Метод Бурри-Гинса (выявление капсулы)

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают кра­ситель, и для их выявления чаще всего применяют метод нега­тивного контрастирования.

Методика окраски по Бурри-Гинсу

1. На середину предметного стекла наносят капельку черной туши и смешивают ее с каплей культуры капсульных бактерий с помощью петли.

2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени го­релки.

3. Окрашивают 5 минут карболовым фуксином, разведен­ным водой 1:3.

4. Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Самостоятельная работа студента

На практическом занятии

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Изучить метод окраски по Граму	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Граму. 2. Поставьте опыт окраски по Граму. Цель опыта: определить, имеет ли метод Грама преимущество перед простым методом, и в чем оно состоит; опреде­лить, в каких случаях целесообразно применение метода окраски по Граму. Материал: стафилококки (грамположи­тельные бактерии) и кишечные палочки (грамотри-цательные бактерии). Ход опыта: приготовить три одинако­вых мазка из смеси стафилококков и кишечных палочек; окрасить один ма­зок водным фуксином, второй – генцианвиолетом, третий – по Граму. Результат: три рисунка и их описание. Вывод: (вывод содержит ответы на во­просы, поставленные в цели опыта).
II. Изучить метод окраски по Цилю-Нильсену	1. Внимательно проследите за демон­страцией преподавателем техники окраски по Цилю-Нильсену. 2. Поставьте опыт окраски по Цилю-Нильсену. Цель опыта: определить, имеет ли метод Циля-Нильсена преимущество перед простым способом окраски, и в чем оно состоит; в каких случаях целесо­образно применение этого метода. Материал: два мазка из смеси туберку­лезной палочки (кислотоустойчивые бактерии) и кишечных палочек (кислотоподатливые бактерии). Ход опыта: окрасьте один мазок про­стым способом (метиленовой синью), второй — по Цилю-Нильсену. Результат: два рисунка и их описание. Вывод. 3. Изобразите критерии окраски по Ци­лю-Нильсену в виде схемы.
III. Сдать выполненную работу препода­вателю	Дайте на просмотр преподавателю пре­параты и тетрадь, приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.
IV. Изучить капсулы бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте демон-страционный препарат из культу­ры палочки Фридлендера, окрашен­ный по способу Гинса; капсулы на ри­сунке укажите стрелкой.
V. Изучить споры бак­терий	Промикроскопируйте и зарисуйте мазок из культуры антракоидной палочки, окрашенной по способу Циля-Нильсена; споры на рисунке отметьте стрелкой.
VI. Изучить жгутики бактерий и подвиж-­ ность	1. Внимательно проследите за демонстра­цией преподавателем техники приго­товления и микроскопирования пре­паратов «раздав-ленной» и «висячей» капли. Приготовьте препараты из культуры подвижных бактерий. 2. Промикроскопируйте демонстрацион­ные пробирки с полужидким агаром, засеянные подвижными и неподвиж­ными микробами. Результаты зарисуйте и дайте объясне­ние их в дневник.
VII. Изучить включения бактерий	Промикроскопируйте и зарисуйте готовые мазки из культур дифтерийной и сенной палочек. Включения на рисунке отметьте стрел­кой и объясните в дневнике причину окраски тела и включений бактерий в разные цвета.
VIII. Изучить ультра- микроскопическую структуру бактерий	Посмотрите таблицы с электронограммами бактерий и обсудите вместе с преподавателем тонкую структуру клеточной стенки, строение цитоплазматической мембраны, включений.
IX. Сдать выполненную работу	Продемонстрируйте преподавателю приготов-ленные Вами препараты «раздавленной» и «висячей» капли, технику их микроскопии; дайте на просмотр преподавателю тетради; приведите в порядок рабочее место и сдайте его дежурному студенту.

Контрольные вопросы

 

1. Перечислить основные этапы развития микробиологии и фамилии ученых, работы которых определили появление новых этапов.

2. Перечислите основные открытия Л. Пастера, Р. Коха, И.И. Мечникова.

3. Назовите отрасли микробиологии.

4. Основные разделы медицинской микробиологии.

5. Классификационные категории в микробиологии. Что та­кое бинарная номенклатура?

6. Как пишутся названия микробов (приведите примеры), группы микроорга­низмов?

7. Основные формы бактерий.

8. Как называются кокки, располагающиеся попарно? Цепоч­кой? Гроздьями? По четыре? Пакетами?

9. Как называются палочки, образующие споры? Не обра­зующие споры?

10. Как называются извитые формы с одним завитком спирали? С несколькими завитками спирали?

11. Каким будет общее увеличение микроскопа: окуляр ×10, объектив 8? Окуляр ×10, объектив 40? Окуляр ×10, объектив 90?

12. Чему равна разрешающая способность микроскопа с иммер­сионным объективом? Какова роль иммерсионного масла?

13. Перечислите структурные элементы бактериальной клетки: постоянные и непостоянные.

14. Оболочка бактерий, ее биологическая роль.

15. Какую форму принимает цитоплазма, искусственно лишен­ная оболочки?

16. Способ выявления оболочки.

17. Капсула, ее биологическая роль у патогенных бактерий.

18. Способ выявления капсулы в препаратах.

19. Перечислите патогенные бактерии, образующие капсулу.

20. Перечислите спорообразующие палочки.

21. Биологическая роль спор.

22. Процесс образования споры, условия и время, необходимые для этого процесса.

23. Процесс прорастания вегетативных форм бактерий из спор.

24. Как могут располагаться споры в теле бактерий?

25. Способ выявления спор в препаратах.

26. Включения бактерий, их биологическая роль, способ выяв­ления.

27. Биологическая роль жгутиков у бактерий. Как можно уви­деть жгутики у бактерий?

 

 

 

Часть II

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

 

Тема:«Питание и дыхание бактерий. Питательные среды.

Выделение чистых культур аэробов и анаэробов. Бактериологический метод исследования»

Цель:

– на основании знания особенностей физиологии мик­роорганизмов

научиться проводить бактериологиче­ский метод исследования.

Задачи:

– освоить механизм питания и дыхания бактерий;

– научиться методам культивирования аэробов и анаэробов;

– овладеть основными методами микробиологи­ческой техники;

– уметь выбрать питательную среду для культиви­рования микробов

(аэробов и анаэробов);

– овладеть методами выделения чистых культур и их

идентификации.

 

Изучение физиологических и биохимических свойств мик­робов требует специальных методик исследования, в соот­ветствии с чем в данном разделе изложены основы микробиоло­гической техники, методы выделения чистых культур, идентифи­кации, методы приготовления питательных сред, методы стери­лизации и т.д.

Знание бактериологических методов исследования патоло­гического материала служит основой для изучения всех после­дующих разделов микробиологической диагностики. Прежде всего, необходимо выделить чистую культуру бактерий. Для ее получения необходимо иметь питательные среды и владеть методами выделе­ния чистой культуры.

Для культивирования микроорганизмов в баклабораториях используются искусственные питательные среды.

По химическому составу и характеру биополимеров (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) прокариотические клетки не отличаются от эукариотических. Основными химическими компонентами бактериальной клетки являются органогены (кислород, водород, углерод, азот, фосфор). Процесс, в ходе которого бактериальная клетка получает из окружающей среды компоненты, необходимые для построения ее биополимеров, называется питанием.

Метаболизм бактерий представляет собой совокупность двух противо­положных, но взаимосвязанных процессов – катаболизма и анаболизма. Катаболизм (диссимиляция) – распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ. Ана­болизм (ассимиляция) – синтез веществ с затратой энергии. Метаболизм бак­терий исследуют с помощью биохимических и физико-химических методов в процессе культивирования бактерий в определенных условиях на питатель­ных средах, содержащих те или иные субстраты.

К особенностям метаболизма у бактерий относятся:

§ преобладание процессов диссимиляции над процессами ассимиляции;

§ высокая интенсивность процессов метаболизма, обусловленная тем, что соотношение поверхности к единице массы больше, чем у многоклеточных;

§ очень широкий субстратный спектр потребляемых бактериями ве­ществ – от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соеди­нений, включая антропогенные вещества – загрязнители окружающей среды;

§ очень широкий набор ферментов – это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов.

Ферменты бактерий делятся на следующие группы: экзоферменты, вы­деляемые во внешнюю среду и действующие на субстрат вне клетки (напри­мер, протеазы, полисахаридазы, олигосахаридазы), и эндоферменты, дей­ствующие на субстраты внутри клетки (например, ферменты, расщепляю­щие аминокислоты, моносахары, синтетазы).

Синтез ферментов генетически детерминирован, но его регуляция идет за счет прямой и обратной связи, т. е. для одних ферментов репрессируется, а для других инициируется субстратом. Ферменты, синтез которых зависит от наличия соответствующего субстрата в среде (например, β-галактозидаза, β-лактамаза) называются индуцибельными. Другая группа ферментов, синтез которых не зависит от наличия субстрата в среде, называется конститутивными. Они в определенных концентрациях всегда содержатся в микробных клетках.

Для диагностики, изучения и в биотехнологических целях микроорганизмы культивируют на искусственных питательных средах.