Видоизменения метода окраски по Граму



Мы поможем в написании ваших работ!


Мы поможем в написании ваших работ!



Мы поможем в написании ваших работ!


ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Видоизменения метода окраски по Граму



Как уже упоминалось выше, окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделить бактерии на две группы: грамположительные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор, как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубли­кованы многочисленные модификации окраски по Граму. Мазок бактерий для окрашивания на предметном стекле получают прямым методом из куль­туры на жидкой или твердой среде, но лучше всего приготовить его из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспендирование бактерий в 5%-ном (объем/объем) формалине, сбор и промывку их центрифугированием, окупаются тем, что размер и форма клеток хорошо сохра­няются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспоря­дочно разбросанные преципитаты из жидких культуральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендует­ся высушивать мазок на воздухе и фиксировать его на­греванием, как для простого окрашивания. Важно стан­дартизировать методику окраски по Граму. Одина­ковые результаты дают еще два способа окраски — в моди­фикации Хукера и в модификации Берка.

Окраска по Граму в модификации Хукера.

Раствор А для приготовления красящего реактива:
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества) 2,0 г
Этанол 95% (объем/объем) 20 мл
Раствор Б для приготовления красящего реактива:
Щавелевокислый аммоний 0,8 г
Дистиллированная вода 80 мл

Растворы А и Б смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Оставляют на 24 ч и перед исполь­зованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

 

Протрава:
Йод 1,0 г
Йодистый калий 2,0 г
Дистиллированная вода 300 мл

Йод и йодистый калий размельчают в ступке и медленно добав­ляют воду при постоянно продолжающемся размельчении, пока йод не растворится. Хранят в темной склянке.

 

Растворитель для обесцвечивания:
Этанол 95% (объем/объем)
Дополнительный краситель:
Сафранин О [2,5% (вес/объем) в 95% (объем/объем) этаноле] 10 мл.
Дистиллированная вода 100 мл

Выполнение метода:

1. Высушенный на воздухе фиксированный нагрева­нием бактериальный мазок погружают на 1 минуту в кра­сящий раствор кристаллического фиолетового.

2. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с.

3. Мазок помещают в йодную протраву на 1 минуту.

4. Промывают его в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего подсушивают промокательной бумагой.

5. Погружают мазок на 30 с в 95%-ный этанол, взбалтывая последний, после чего мазок подсушивают промокательной бумагой.

6. Погружают мазок на 10 с в дополнительный кра­ситель.

7. Промывают мазок в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего подсушивают промокательной бумагой.

Окраска по Граму в модификации Берка.

Раствор А:
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества) 1,0 г
Дистиллированная вода 100 мл
Раствор Б:
Двууглекислый натрий 1,0 г
Дистиллированная вода 100 мл
Йодная протрава:
Йод 1,0 г
Йодистый калий 2,0 г
Дистиллированная вода 100 мл

Протраву готовят так же, как для модификации Хукера.

Растворитель для обесцвечивания: ( осторожно, легко воспламеняется!)
Этиловый эфир 1 объем
Ацетон 3 объема
Дополнительный краситель:
Сафранин О (с 85% содержанием сухого вещества) 2,0 г
Дистиллированная вода 100 мл

Выполнение метода:

1. Высушенный на воздухе фиксированный нагрева­нием мазок погружают в раствор А, добавляют 2—3 капли раствора Б и выдерживают в те­чение 2 минут.

2. Отмывают мазок йодной протравой, после чего покрывают его на 2 минуты свежей протравой.

3. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с. Поверхность вокруг мазка подсушивают промокательной бумагой, но сам мазок предохраняют от высыхания.

4. На мазок при наклонном положении предметного стекла по каплям наносят обесцвечивающий раствори­тель до тех пор, пока в стекающем со стекла раство­рителе не исчезнет окраска. После этого мазок подсу­шивают на воздухе.

5. На 5—10 с мазок погружают в дополнительный краситель.

6. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают фильтровальной бумагой.

При использовании любой методики грамположительные бактерии окрашиваются в голубой или фиолето­вый цвет, а грамотрицательные—в красный.

Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальный мазок слиш­ком толст, а обесцвечивание не проведено до конца. В то же время грамположительные микроорганизмы мо­гут выглядеть как грамотрицательные, если мазок че­ресчур обесцвечен; это особенно характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды рода Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если механически нарушена це­лостность их клеточных стенок в результате гибели кле­ток, автолиза, действия ферментов (например, лизоцима), высушивания на стекле и последующего увлажне­ния. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные мазки (со слабой замутненностью) из молодых, активно растущих куль­тур, так как более старые культуры могут показывать неустойчивые реакции. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Модификация по Синеву.

Вариант Синева: вместо карболового или анилинового раствора генцианвиолета берут по­лоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные следующим раствором:

Кристаллвиолет 1 г
Спирт 96° 100 мл
Глицерин (не обязательно) 5 мл

Кристаллвиолет может быть заменен метилвиолетом или генцианвиолетом в равных количествах. Через сутки стояния раствор краски готов и может сохраняться долгое время. Фильтровальную бумагу (один слой), помещен­ную на стекло, обливают указанным раствором краски, высушивают и режут на полоски размером 20´40 мм; бумажки хранят в темной склянке с при­тертой пробкой.

Клемпарская предлагает для окраски препаратов по методу Грама в модифика­ции Синева при отсутствии фильтровальной бумаги пропитывать 10% спир­товым раствором генцианвиолета полоски обыкновенной газетной бумаги (типографская краска не мешает). Техника окраски та же.

Техника окраски. На фиксированный мазок наливают 2—3 капли дистиллированной воды, опускают и придавливают к стеклу пинцетом полоску бумаги, приготовленной вышеуказанным способом. Бумажку через 2 минуты смывают водой или, лучше, снимают пинцетом. Дальше производится обработка раствором Люголя, спиртом или йодированным спиртом, водой и дополнительная окраска.

Модификация по Синеву особенно удобна для походных лабораторий, в экспедиционной работе и т. п.; получаются хорошие препараты, свободные от осадков, при малом расходе краски.

Клемпарская рекомендует готовить красящие бумажки для метода Грама и Циль-Нильсена по следующей прописи: для основной окраски (кристаллвиолет, генцианвиолет и метилвиолет) к 1 г краски добавить 10 мл спирта и 0,5 мл глицерина (краску всыпать в спирт и добавить глицерин), для фуксина — 10 мл спирта; для дополнительной окраски (сафранин, метиленовая синька)—к 1 г краски добавить 10 мл нагретого до 45—50° спирта, 1 мл насыщенного водного раствора буры и 0,5 мл глицерина (сна­чала нагревают спирт, добавляют буру и глицерин, а затем краску); для раствора Люголя — к 1 г кристаллического йода добавить 2,5 г йодистого калия и 10 мл дистиллированной воды.

Модификация по Эткинсу.

Для данной модификации можно при­менять любую из красок, относящихся к производным парарозанилина (кристаллвиолет, генцианвиолет или метилвиолет), с раствором сернокислого анилина. Растворы красок получаются очень стойкие и совершенно не дают осадков. Для окраски необходимы следующие растворы:

 

I. Генцианвиолет
Насыщенный спиртовой раствор 1 часть
Сернокислый анилин (1% водный раствор) 3 части

При отсутствии готового сернокислого анилина таковой может быть приготовлен следующим образом. К 100 мл 5% водного раствора серной кислоты прибавляют по каплям 20 мл анилинового масла. Выпавший обиль­ный рыхлый белый осадок отфильтровывают, снимают с фильтра и разбав­ляют в 30 мл 95° спирта, а затем снова отфильтровывают и осадок высу­шивают.

II. Раствор йода
Кристаллический йод 2 г
Едкий натр (4%) 10 мл

После растворения прибавляют 90 мл дистиллированной воды.

Для дополнительной окраски применяют спирто-водный сафранин (можно везувин или пиронин): 1 часть насыщенного спиртового раствора краски на 10 частей дистиллированной воды.

Техника окраски:

1) окрасить мазок раствором I в течение минуты,

2) промыть водой,

3) обработать раствором II в течение минуты,

4) обесцве­тить спиртом в течение 5 минут,

5) дополнительно окрасить в течение 10 секунд,

6) промыть водой и высушить.



Последнее изменение этой страницы: 2016-04-23; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.204.2.146 (0.005 с.)