Видоизменения метода окраски по Граму

Как уже упоминалось выше, окраска по Граму представляет собой самый важный метод идентификации бактерий. Теоретически возможно разделить бактерии на две группы: грамположительные и грамотрицательные; реально же имеются случаи, когда одни и те же бактерии характеризуются как «грамвариабельные». С тех пор, как метод был впервые разработан Кристианом Грамом в 1884 г., опубли­кованы многочисленные модификации окраски по Граму. Мазок бактерий для окрашивания на предметном стекле получают прямым методом из куль­туры на жидкой или твердой среде, но лучше всего приготовить его из фиксированной формалином отмытой пробы. Несколько дополнительных минут, потраченных на суспендирование бактерий в 5%-ном (объем/объем) формалине, сбор и промывку их центрифугированием, окупаются тем, что размер и форма клеток хорошо сохра­няются, клетки прокрашиваются равномерно, а беспоря­дочно разбросанные преципитаты из жидких культуральных сред отсутствуют. В любом случае рекомендует­ся высушивать мазок на воздухе и фиксировать его на­греванием, как для простого окрашивания. Важно стан­дартизировать методику окраски по Граму. Одина­ковые результаты дают еще два способа окраски — в моди­фикации Хукера и в модификации Берка.

Окраска по Граму в модификации Хукера.

Раствор А для приготовления красящего реактива:
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества)	2,0 г
Этанол 95% (объем/объем)	20 мл
Раствор Б для приготовления красящего реактива:
Щавелевокислый аммоний	0,8 г
Дистиллированная вода	80 мл

Растворы А и Б смешивают для получения красящего реактива кристаллического фиолетового. Оставляют на 24 ч и перед исполь­зованием фильтруют через фильтровальную бумагу.

 

Протрава:
Йод	1,0 г
Йодистый калий	2,0 г
Дистиллированная вода	300 мл

Йод и йодистый калий размельчают в ступке и медленно добав­ляют воду при постоянно продолжающемся размельчении, пока йод не растворится. Хранят в темной склянке.

 

Растворитель для обесцвечивания:
Этанол 95% (объем/объем)
Дополнительный краситель:
Сафранин О [2,5% (вес/объем) в 95% (объем/объем) этаноле]	10 мл.
Дистиллированная вода	100 мл

Выполнение метода:

1. Высушенный на воздухе фиксированный нагрева­нием бактериальный мазок погружают на 1 минуту в кра­сящий раствор кристаллического фиолетового.

2. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с.

3. Мазок помещают в йодную протраву на 1 минуту.

4. Промывают его в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды в течение 2 с, после чего подсушивают промокательной бумагой.

5. Погружают мазок на 30 с в 95%-ный этанол, взбалтывая последний, после чего мазок подсушивают промокательной бумагой.

6. Погружают мазок на 10 с в дополнительный кра­ситель.

7. Промывают мазок в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, после чего подсушивают промокательной бумагой.

Окраска по Граму в модификации Берка.

Раствор А:
Кристаллический фиолетовый (с 90% содержанием сухого вещества)	1,0 г
Дистиллированная вода	100 мл
Раствор Б:
Двууглекислый натрий	1,0 г
Дистиллированная вода	100 мл
Йодная протрава:
Йод	1,0 г
Йодистый калий	2,0 г
Дистиллированная вода	100 мл

Протраву готовят так же, как для модификации Хукера.

Растворитель для обесцвечивания: (осторожно, легко воспламеняется!)
Этиловый эфир	1 объем
Ацетон	3 объема
Дополнительный краситель:
Сафранин О (с 85% содержанием сухого вещества)	2,0 г
Дистиллированная вода	100 мл

Выполнение метода:

1. Высушенный на воздухе фиксированный нагрева­нием мазок погружают в раствор А, добавляют 2—3 капли раствора Б и выдерживают в те­чение 2 минут.

2. Отмывают мазок йодной протравой, после чего покрывают его на 2 минуты свежей протравой.

3. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе воды из-под крана в течение 2 с. Поверхность вокруг мазка подсушивают промокательной бумагой, но сам мазок предохраняют от высыхания.

4. На мазок при наклонном положении предметного стекла по каплям наносят обесцвечивающий раствори­тель до тех пор, пока в стекающем со стекла раство­рителе не исчезнет окраска. После этого мазок подсу­шивают на воздухе.

5. На 5—10 с мазок погружают в дополнительный краситель.

6. Мазок промывают в слабой, идущей под углом струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке и подсушивают фильтровальной бумагой.

При использовании любой методики грамположительные бактерии окрашиваются в голубой или фиолето­вый цвет, а грамотрицательные—в красный.

Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальный мазок слиш­ком толст, а обесцвечивание не проведено до конца. В то же время грамположительные микроорганизмы мо­гут выглядеть как грамотрицательные, если мазок че­ресчур обесцвечен; это особенно характерно для культур, очень долго находившихся в стационарной фазе роста. Некоторые виды рода Bacillus грамположительны лишь в течение нескольких делений после прорастания спор. Грамположительные организмы могут окраситься как грамотрицательные, если механически нарушена це­лостность их клеточных стенок в результате гибели кле­ток, автолиза, действия ферментов (например, лизоцима), высушивания на стекле и последующего увлажне­ния. Для получения хороших результатов лучше всего готовить относительно прозрачные мазки (со слабой замутненностью) из молодых, активно растущих куль­тур, так как более старые культуры могут показывать неустойчивые реакции. Целесообразно в качестве контроля использовать известные грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.

Модификация по Синеву.

Вариант Синева: вместо карболового или анилинового раствора генцианвиолета берут по­лоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные следующим раствором:

Кристаллвиолет	1 г
Спирт 96°	100 мл
Глицерин (не обязательно)	5 мл

Кристаллвиолет может быть заменен метилвиолетом или генцианвиолетом в равных количествах. Через сутки стояния раствор краски готов и может сохраняться долгое время. Фильтровальную бумагу (один слой), помещен­ную на стекло, обливают указанным раствором краски, высушивают и режут на полоски размером 20´40 мм; бумажки хранят в темной склянке с при­тертой пробкой.

Клемпарская предлагает для окраски препаратов по методу Грама в модифика­ции Синева при отсутствии фильтровальной бумаги пропитывать 10% спир­товым раствором генцианвиолета полоски обыкновенной газетной бумаги (типографская краска не мешает). Техника окраски та же.

Техника окраски. На фиксированный мазок наливают 2—3 капли дистиллированной воды, опускают и придавливают к стеклу пинцетом полоску бумаги, приготовленной вышеуказанным способом. Бумажку через 2 минуты смывают водой или, лучше, снимают пинцетом. Дальше производится обработка раствором Люголя, спиртом или йодированным спиртом, водой и дополнительная окраска.

Модификация по Синеву особенно удобна для походных лабораторий, в экспедиционной работе и т. п.; получаются хорошие препараты, свободные от осадков, при малом расходе краски.

Клемпарская рекомендует готовить красящие бумажки для метода Грама и Циль-Нильсена по следующей прописи: для основной окраски (кристаллвиолет, генцианвиолет и метилвиолет) к 1 г краски добавить 10 мл спирта и 0,5 мл глицерина (краску всыпать в спирт и добавить глицерин), для фуксина — 10 мл спирта; для дополнительной окраски (сафранин, метиленовая синька)—к 1 г краски добавить 10 мл нагретого до 45—50° спирта, 1 мл насыщенного водного раствора буры и 0,5 мл глицерина (сна­чала нагревают спирт, добавляют буру и глицерин, а затем краску); для раствора Люголя — к 1 г кристаллического йода добавить 2,5 г йодистого калия и 10 мл дистиллированной воды.

Модификация по Эткинсу.

Для данной модификации можно при­менять любую из красок, относящихся к производным парарозанилина (кристаллвиолет, генцианвиолет или метилвиолет), с раствором сернокислого анилина. Растворы красок получаются очень стойкие и совершенно не дают осадков. Для окраски необходимы следующие растворы:

 

I. Генцианвиолет
Насыщенный спиртовой раствор	1 часть
Сернокислый анилин (1% водный раствор)	3 части

При отсутствии готового сернокислого анилина таковой может быть приготовлен следующим образом. К 100 мл 5% водного раствора серной кислоты прибавляют по каплям 20 мл анилинового масла. Выпавший обиль­ный рыхлый белый осадок отфильтровывают, снимают с фильтра и разбав­ляют в 30 мл 95° спирта, а затем снова отфильтровывают и осадок высу­шивают.

II. Раствор йода
Кристаллический йод	2 г
Едкий натр (4%)	10 мл

После растворения прибавляют 90 мл дистиллированной воды.

Для дополнительной окраски применяют спирто-водный сафранин (можно везувин или пиронин): 1 часть насыщенного спиртового раствора краски на 10 частей дистиллированной воды.

Техника окраски:

1) окрасить мазок раствором I в течение минуты,

2) промыть водой,

3) обработать раствором II в течение минуты,

4) обесцве­тить спиртом в течение 5 минут,

5) дополнительно окрасить в течение 10 секунд,

6) промыть водой и высушить.