Фазовоконтрастная микроскопия

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. Это достигается с помощью фазовоконтрастного конденсора и фазового объектива (рис. 16).

Рис. 16. Схема фазово-контрастного микроскопа (Стейниер Р. и др., 1979).

Фазовоконтрастный конденсор представляет собой обычный объектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую получают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Фазовоконтрастная микроскопия значительно повышает контрастность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, ФИТЦ, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к нему (рис. 17). Очень важно использование нефлюоресцентного иммерсионного масла.

Рис. 17. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа: 1. Дуговая лампа; 2. Кварцевый коллектор; 3. Кювета, заполненная раствором сернокислой меди; 4. Передняя часть коллектора; 5. Ультрафиолетовый фильтр; 6. Призма; 7. Пластинка из уранового стекла; 8. Окулярный фильтр, поглощающий ультрафиолетовые лучи (Экспериментальная микробиология, 1965).

Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний с помощью реакции иммунофлюоресценции.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большойдлиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис. 18).

В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электронов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут соответственно задерживаться, что проявится на экране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.

Рис. 18. Схема трансмиссионного электронного микроскопа (Стейниер Р. и др., 1979).

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследую объекты после их высушивания («нативные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые мелкие структуры, получит увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

МОРФОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП ПРОКАРИОТ: АКТИНОМИЦЕТОВ, СПИРОХЕТ, МИКОПЛАЗМ, РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ.

Актиномицеты (actinomyces – от греч. – луч, mykes - гриб) представляют своеобразную группу бактерий, имеющих вид небольших или длинных несептированных ветвящихся нитей длиной от 50 до 600 мкм и диаметром от 0, 2 до 1-2 мкм, названных гифами. Скопление гифов называют мицелием. Мицелий развивается из небольшой почки, которая постепенно вытягивается в палочку, а затем в короткую нить с боковыми ответвлениями. Сходство с грибами чисто внешнее, так как актиномицеты имеют прокариотический тип клетки с наличием клеточной стенки не содержащей хитина и целлюлозы. В состав пептидогликана могут входить галактоза, арабиноза, ксилоза и другие сахара не характерные для остальных бактерий и позволяющие дифференцировать актиномицеты. Актиномицеты грамположительны, многие формы кислотоустойчивы, некоторые актиномицеты вокруг нитей имеют капсулу.

Культуральная форма актиномицетов формирует субстратный мицелий, образующийся в результате врастания мицелия в питательную среду и воздушный, растущий на поверхности среды (рис. 19). В пораженных тканях (тканевая форма) актиномицеты могут образовывать друзы-гранулы, из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся колбовидными утолщениями.

Актиномицеты размножаются бесполым путем, образую конидии или спороносцы со спорангиями на концах воздушного мицелия. Спороносцы могут быть прямыми, волнистыми, спиральными. Споры – овальными, круглыми, цилиндрическими, с гладкой поверхностью или шипами, иногда подвижные за счет жгутиков (зооспоры). Споры служат для размножения актиномицетов, они не термостойки, но выдерживают высушивание. Кроме того, возможно почкование и фрагментация мицелия на палочковидные или кокковидные формы.

 

Рис. 19. Микобактерии, нокардии и актиномицеты: а – форма колоний, характерная для данного рода; б – разрез через заросшую бактериями, поверхность агара. Показаны типичные формы роста субстратного мицелия (СМ) и воздушного мицелия (ВМ), спорофоры (Спф) и спорангии (Спа), а также лишенные жгутиков и обладающие жгутиками споры (спо) (Шлегель Г., 1972).

Актиномицеты широко распространены в природе, обитают в воде, почве богатой перегноем. Они участвуют в круговороте веществ в природе. Отдельные виды актиномицетов используются как продуценты антибиотиков, витаминов, липидов, протеаз, аминокислот, стероидов.

Актиномицеты, являясь симбионтами человека и животных, присутствуют в строме зубного камня, слюнных железах, криптах миндалин, в камнях мочевых и желчевыводящих путей.

Актиномицеты относятся к порядку Аctinomycetalеs, включающего семейства: Actinomycetaceae, Nocardiaceae, Streptomycetaceae, Mycobacteriaceae.

Патогенные для человека виды встречаются среди представителей семейства Actinomycetaceae и Nocardiaceae. Первые имеют вид длинных или коротких разветвленных палочек, не образующих воздушного мицелия. Они являются возбудителями актиномикоза человека и образуют друзы в пораженных тканях.

Представители семейства Nocardiaceae напоминают микобактерии, имеют нитевидную форму клеток и образуют на питательных средах воздушный и субстратный мицелий. Гифы фрагментируются на кокковидные и палочковидные клетки. Патогенные нокардии вызывают нокардиоз.

Некоторые представители семейства Streptomycetaceae вызывают у человека кожные мицетомы.

Семейство Mycobacteriaceae отличается рядом особенностей от истинных актиномицет. Обычно это тонкие, искривленные палочки 2,5-7,0 мкм в длину, не образующие мицелия и ветвящиеся в молодой культуре. Микобактерии кислотоустойчивы в связи с присутствием в клеточной стенке миколовых кислот. Вызывают у человека туберкулез.

Методы исследования. Учитывая особенности роста актиномицетов, мазки из культуры на плотной среде готовят особым способом. Препаровальной иглой отделяют небольшой участок колонии и помещают в каплю воды на предметном стекле, покрывают вторым предметным стеклом и слегка прижимая, раздавливают мицелий. Из полученного материала петлей, обычным способом готовят мазки, окрашивают по Граму и Цилю-Нильсену. Друзу извлекают из патологического материала петлей, помещают в каплю воды на предметное стекло, слегка придавливают покровным, затем вводят под стекло каплю щелочного раствора метиленового синего и микроскопируют с сухим объективом, можно использовать фазовый контраст.

Спирохеты (speira - изгиб, chaite - волосы) спирально извитые, обладающие активной подвижностью бактерии. Размеры спирохет колеблются в толщину от 0,1-0,3 мкм, в длину от 7-500 мкм. Движения разнообразные – от винтообразных до сгибательных. Электронно-микроскопическое исследование позволило различить у спирохет протоплазматический цилиндр (тело клетки), аксиальную (опорную) нить и трехслойную наружную оболочку. Аксиальная нить находится в периплазматическом пространстве между наружной оболочкой и протоплазматическим цилиндром и состоит из отдельных фибрилл (эндофлагелл), число которых у разных видов различно: у трепонем и лептоспир – 3-4; у борелий – до 30. Каждая из фибрилл (эндожгутиков) закрепляется в области прикрепительных дисков на концах протоплазматического цилиндра и тянется к противоположному его концу, обвивая его и заканчиваясь свободно. Химический состав фибрилл аналогичен составу жгутиков (рис. 20).

В протоплазматическом цилиндре содержатся: нуклеоид, рибосомы, мезосомы, включения. Наружная оболочка (клеточная стенка) содержит тонкий слой пептидогликана, эластична и не обладает ригидностью. Эндоспор, капсул и экзожгутиков эти бактерии не образуют, грамотрицательны, в мазке располагаются беспорядочно.

Спирохеты относятся к порядку Spirochaetales, семейство Spirochaetaceae, которое включает три рода:

1. Borrelia - имеет 3-10 неравномерных отлогих завитков, концы заострены, длиной 10-30 мкм. Движение толчкообразное, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (представитель Borrelia recurrentis – вызывает эпидемический возвратный тиф; Borrelia burgdorferi - вызывает лаймоборрелиоз).

2. Treponema - имеет 8-14 туго закрученных, одинаковых по амплитуде завитков, длина 5-15 мкм. Движение плавное, медленное с вращением вокруг продольной оси, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в бледно розовый цвет (представитель Treponema pallidum – возбудитель сифилиса).

3. Leptospira - имеет до двух десятков мелких частых завитков, заканчивающихся крючком с пуговчатым утолщением, длиной 5-15 мкм. Движение очень активное, поступательное перемещение вперед, сгибание и вращение вокруг оси. По Романовскому-Гимзе окрашиваются слабо в розовато-сиреневый цвет (представитель Leptospira interrogans – возбудитель лептоспироза).

Методы исследования. В живом состоянии спирохеты изучают в фазово-контрастном микроскопе и темнопольном микроскопе, наблюдая за активным характерным движением спирохет, особенностями их формы.

Готовят препараты по Бурри (на темном фоне препарата становятся видимыми светлые извитые нити спирохет), окрашивают по Романовскому-Гимзе, по методу Морозова.

Микоплазмы – самые мелкие прокариоты (125-150 нм) способные самостоятельно размножаться. Полагают, что микоплазмы являются наиболее близкими потомками исходных прокариотических клеток. Геном микоплазм минимален для клетки, он в пять раз меньше генома кишечной палочки и составляет 0,45 МД. Главная особенность микоплазм – отсутствие клеточной стенки. Они окружены капсулоподобным слоем, под которым находится лишь тонкая трехслойная мембрана толщиной 7,5- 10 нм, содержащая в значительном количестве холестерин. Вследствие этого, микоплазмы выделяют в особый отдел Tenericutes, класс Mollicutes («нежная кожа»), порядок Mycoplasmatales.

Рис. 20. Клетка спирохеты. А. Протоплазматический цилиндр (ПЦ), обвит аксостилем, состоящим в данном случае из двух осевых фибрилл (АФ), каждая из которых на одном конце прикреплена к протоплазматическому цилиндру (ПП – прикрепительная пора). Фибриллы, идущие от разных концов клетки, перекрываются. Аксостиль и протоплазматический цилиндр окружены наружной оболочкой (НО). КСт – клеточная стенка; ПМ – плазматическая мембрана; ЦП – цитоплазма (Голт С., 1978). Б и В. Электронные микрофотографии поперечного среза (Б, 110 000 х) и всей клетки (В, 7 000 х) спирохеты из ротовой полости с несколькими осевыми фибриллами (Листгартен Г., 1964).

Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы (рис. 21) осмотически чувствительны и имеют разнообразную форму:

а) мелкие сферические или овоидные клетки размером 0,2 мкм (элементарные тельца) которые фильтруются через бактериальные фильтры;

б) более крупные шаровидные, размером до 1,5 мкм;

в) нитевидные, ветвящиеся клетки размером до 150 мкм.

Рис. 21. Микоплазмы, растущие в питательном растворе клетки возбудителя бронхопневмонии крыс; электронная микрофотография, 11 200 х (Клейнбергер-Нобель Е., 1955).

Микоплазмы не образуют спор, жгутиков, некоторые виды обладают скользящей подвижностью.

Размножаются путем бинарного деления шаровидных и нитевидных клеток, почкования и высвобождения множества элементарных телец, образующихся в нитях.

Для микоплазм характерна уникальная для прокариот потребность в стеролах (холестерине). Холестерин стабилизирует мембрану микоплазм. В инфицированных тканях микоплазмы являются паразитами мембран эукариотических клеток и способны персистировать на них долгое время.

Что касается энергии, то микоплазмы получают ее обычным для факультативных анаэробов способом, ферментируя углеводы или аминокислоты. Вследствие малого генома микоплазмы обладают ограниченными биосинтетическими способностями, и их приходится культивировать на питательных средах обогащенных липидами, белками, предшественниками нуклеиновых кислот. Растут медленно, колонии с плотным врастающим в среду центром, напоминающие «яичницу-глазунью» (темный центр и более светлая ажурная периферия). Размеры колоний мелкие, не превышающие 600 мкм (рис. 22).

Рис. 22. Колония М. salivarium. Типичный вид «яичницы-глазуньи» (плотный врастающий в среду центр и рыхлая периферия) (Burrows Textbook of Microbiology, 1985).

Большинство микоплазм являются безвредными комменсалами слизистых оболочек глаз, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей человека.

В патологии человека наибольшую роль играют несколько представителей рода Mycoplasma: M. pneumoniae, M. hominis, M. anthritidis и единственный вид рода Ureaplasma – U. urealyticum (названный так из-за уреазной активности). Патогенные микоплазмы вызывают заболевания (микоплазмозы) дыхательных, мочеполовых путей и суставов с разнообразными клиническими проявлениями. При лечении этих заболеваний следует помнить, что микоплазмы не чувствительны к бета-лактамным антибиотикам и другим лекарственным препаратам, угнетающим синтез клеточной стенки (из-за ее отсутствия у возбудителя).

Методы исследования. В световом микроскопе обнаруживаются лишь самые крупные формы микоплазм. В живом состоянии их изучают в темнопольном и фазово-контрастном микроскопе, ультраструктурные компоненты выявляют при помощи электронной микроскопии.

Риккетсии – мелкие (0,35-1.0 мкм) грамотрицательные, полиморфные бактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами.

Риккетсии разнообразны по форме и выделяют следующие типы:

1. кокковидные однозернистые (до 0,5 мкм);

2. палочковидные двухзернистые (1-1,5 мкм);

3. бациллярные трех-четырехзернистые (3-4 мкм);

4. нитевидные многозернистые (10-40 мкм).

Зерна (нуклеопротеиды) обнаруживаются при окраске по Романовскому-Гимзе. Все формы взаимообратимы. Структурно имеют все компоненты бактериальной клетки: клеточную стенку, липоидную капсулу, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, пили. Риккетсии содержат как ДНК, так и РНК, обладают высоким содержанием фосфолипидов, содержание углеводов невелико.

В большинстве случаев (кроме вида Rochalimaea guintana) на искусственных питательных средах риккетсии не растут. Жизненный цикл риккетсий зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из двух стадий: вегетативной и покоящейся (элементарные тельца). Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии (рис. 23) активно размножаются путем бинарного деления и обладают активной подвижностью, по-видимому, обусловленной жгутиковыми структурами. Риккетсии покоящейся стадии (элементарные тельца) имеют сферическую форму и они не активны.

Риккетсии способны к биосинтезу белка, но не могут самостоятельно получать макроэргические соединения, поэтому их можно назвать «энергетическими паразитами» клеток-эукариотов. В связи с этим, для культивирования риккетсий обычно заражают куриные эмбрионы в желточный мешок (метод Кокса), культуры клеток, в которых некоторые виды риккетсий образуют, как и вирусы, тельца включений. Реже заражают чувствительных лабораторных животных: морских свинок, белых мышей.

Порядок Rickettsiales включает виды патогенные для теплокровных животных и человека, переносчиками служат вши, блохи, клещи. Заболевания называются риккетсиозами. Большинство болезнетворных для человека видов риккетсий входит в состав семейства Rickettsiaceae, роды Rickettsia, Rochalimaea, Coxiella, вызывая эпидемический сыпной тиф (Rickettsia prowazekii), Ку-лихорадку (Coxiella burnetti), волынскую лихорадку (Rochalimaea guintana), лихорадку цуцугамуши (Rickettsia tsutsugamushi) и другие. Паразитирующие виды ассоциированы с ретикулоэндотелиальными клетками и клетками эндотелия сосудов или эритроцитами.

Рис. 23. Rickettsia prowazekii в культуре ткани: а – видны отчетливо внутренний слой (вкс) и наружный слой (нкс) клеточной стенки, представленной трехслойной мембраной, цитоплазматическая мембрана (цм) и ядерное вещество (н); б – видны микрокапсула (мк), клеточная стенка (кс) и перетяжка (п), делящая клетку как у большинства грамотрицательных бактерий. х 72 000, х 108 000 соответственно (Авакян А.А., Кач Л.Н., Павлова И.Б., 1972).

Методы исследования. Риккетсии хорошо окрашиваются по Романовскому-Гимзе в сиреневый цвет, по Морозову (методом серебрения) в черный цвет.

Для дифференциации риккетсий применяется метод окраски, предложенный П.Ф. Здродовским:

1. Тонкие фиксированные мазки окрашиваются водным карболфуксином (из расчета 10 капель карболового фуксина Циля на 10 мл фосфатного буфера рН – 7,4) в течение 5 мин.

2. Мазок промывают водой и обрабатывают 0,5% раствором лимонной кислоты (1-3 сек).

3. Хорошо промывают водой и докрашивают 10 сек, 0,5% водным раствором метиленового синего.

4. Промывают водой и высушивают.

Риккетсии окрашиваются в рубиново-красный цвет и легко обнаруживаются на фоне голубой цитоплазмы и синего ядра клеток.

Хламидии - неподвижные, облигатно паразитические, кокковидные бактерии. Размножаются только внутри связанных с мембраной вакуолей в цитоплазме клеток человека, млекопитающих, птиц. Членистоногие не служат хозяевами или переносчиками. Размножение происходит в ходе уникального цикла развития. Основными стадиями жизненного цикла хламидий являются:

1). Элементарные тельца – мелкие (0,2-0,5 мкм) электронноплотные шаровидные структуры, лишенные метаболитной активности, имеющие компактный нуклеоид и ригидную клеточную стенку, которые фильтруются через бактериальные фильтры. Они являются инфекционным началом хламидий и обеспечивают их выживание во внеклеточной среде и заражение новых клеток.

2). Ретикулярные тельца – более крупные (0,8-1,5 мкм), сферические образования, имеющие сетчатую структуру с тонкой клеточной стенкой и фибриллярным нуклеоидом. Они вырастают из элементарных телец внутри клеток, лишены инфекционности и, подвергаясь делению, обеспечивают репродукцию хламидий. Отсюда другое, исторически первое название ретикулярных телец – «инициальное тело». Ретикулярные тельца являются вегетативной формой хламидий.

3). Промежуточные тельца – промежуточная стадия между элементарными и ретикулярными тельцами.

Жизненный цикл хламидий начинается с того, что элементарные тельца фагоцитируются клеткой-хозяином, а затем в течение нескольких часов реорганизуются, увеличиваются в размерах и превращаются в ретикулярные формы, которые размножаются путем поперечного деления. Жизненный цикл заканчивается, когда возникающие промежуточные формы уплотняются, уменьшаются в размерах и превращаются в элементарные тельца. Размножаясь внутри цитоплазматических вакуолей, хламидии образуют микроколонии (включения), окруженные мембраной. В составе микроколоний обнаруживаются все три стадии развития хламидий. После разрыва стенки вакуоли (везикулы) и мембраны клетки-хозяина, вновь образовавшиеся хламидии высвобождаются, и элементарные тельца, инфицируя другие клетки, повторяют цикл развития. В оптимальных условиях роста в эукариотических клетках жизненный цикл хламидий составляет 17-40 часов (рис. 24).

Хламидии хорошо размножаются в желточном мешке куриного эмбриона при температуре от 33⁰ – 44⁰С, а также в культурах клеток различных позвоночных. Зависимость хламидий от клеток-эукариотов объясняется их неспособностью аккумулировать и использовать энергию, так как они не могут синтезировать АТФ. В этом отношении хламидии похожи на риккетсий, в связи с чем, эти микроорганизмы также называют «энергетическими паразитами».

Своеобразие хламидий проявляется и в строении их клеточной стенки. Она лишена пептидогликана и представляет собой двухслойную мембрану, ригидность которой определяют пептиды, перекрестно сшитые дисульфидными мостиками. В остальном хламидии напоминают грамотрицательные бактерии, так как содержат гликолипиды, сходные с липополисахаридами (рис. 25).

Рис. 24. Принципиальная схема репликативного цикла хламидий. ЭГ - элементарные тельца, РТ – ретикулярные тельца (C.A. Mims et al. Medical Microbiology. Mosby, 1993).

Порядок Chlamydiales включает одно семейство Chlamydiaceae с единственным родом Chlamydia. Для человека патогенны виды C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae. Хламидии вызывают у людей заболевания глаз, дыхательной и мочеполовой систем и объединяются под общим названием «хламидиозы».

Методы исследования. Для микроскопического обнаружения телец включений (микроколоний) хламидий в инфицированных клетках (тканях) применяют различные методы окрашивания: Романовского-Гимзы, Маккиавелло и другие. При окрашивании по Романовскому-Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Кроме того, хламидии хорошо видны и в неокрашенном состоянии при микроскопии влажных препаратов под стеклом с помощью фазовоконтрастной оптической системы. В последнее время наиболее часто используется прямая реакция иммунофлюоресценции, окраска акридин –оранжевым.

 

 

Рис. 25. Множественные внутриклеточные включения C. psittaci. I - включение, N - ядро клетки. (Topley & Wilson’s Principles of Bacteriology, Virology and Immunity. 8 ed. E. Arnold, 1990).

МОРФОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

МИКРОБОВ-ЭУКАРИОТОВ: ГРИБОВ И ПРОСТЕЙШИХ

Грибы (тип Mycota, Mycetes, Fungi) представлены одноклеточными или многоклеточными эукариотами, которые по наличию хитина в оболочке, стеролов в цитоплазматической мембране и гликогена в цитоплазме напоминают клетки животного происхождения, а по наличию клеточной стенки, состоящей из полисахаридов, близких к целлюлозе; способности к неограниченному росту, размножению спорами, неподвижностью в вегетативном состоянии – растения.

У грибов существует 2 типа роста: гифальный рост (гифомицеты) и дрожжевой рост (бластомицеты). Обычно вегетативное тело гифомицетов состоит из нитей толщиной около 5 мкм, сильно разветвленных и называемых гифами. Гифы либо не имеют поперечных перегородок (у низших грибов), либо разделены перегородками (септами) на клетки (у высших грибов). Стенка клеток может быть различной толщины, часто хорошо видна двухконтурность, среди включений в цитоплазме наиболее характерны зерна волютина, гликогена, пигмента меланина. Зрелые старые клетки грибов богаты липидами. Ядро содержит ядрышко и хроматиновую сеть, клетки могут быть многоядерными. Совокупность гифов образует мицелий (грибницу). Мицелий может быть субстратный, образующийся в результате врастания гифов в питательную среду и воздушный, растущий на поверхности среды. Мицелий представляет ветвящиеся трубки, ветвление осуществляется боковыми выростами гиф. Переплетающиеся гифы с толстыми оболочками образуют склероции – округлые или неправильной формы образования размером от долей мм до нескольких см, предназначенные для выживания в неблагоприятных условиях. Концевые нити некоторых грибов образуют обильные ветвления, по внешнему сходству названные «рогами оленя», «канделябрами», «булавами», «спиралями», «дубинками». По ходу мицелия встречаются узловатые органы различного размера и формы – результат сплетения первичных и вторичных ветвей вокруг материнской ветви. Мицеальные нити иногда располагаются параллельными рядами, тесно прилегая друг к другу, напоминая «фитиль», отсюда и название «коремии» (у дерматофитов).

У большинства грибов, имеющих медицинское значение, обнаруживаются разнообразные конидии (экзоспоры), являющиеся формами бесполого размножения (рис. 26). Они могут образовываться на специальных конидиофорах (конидиеносцы), а также по бокам и на концах обычных септированных гиф. Мелкие одноклеточные конидии называются микроконидиями, а крупные, часто многоклеточные - макроконидиями. Наиболее частыми типами конидий являются следующие типы спор:

1. Бластоспоры – образуются в результате почкования, путем отделения почки от родительской клетки, наблюдается у дрожжевых и дрожжеподобных грибов;

2. Хламидоспоры – гифальные клетки увеличиваются, у них образуется толстая оболочка;

3. Артроспоры – образуются в результате фрагментации гиф на отдельные клетки, встречаются у дерматофитов, дрожжеподобных грибов, возбудителя кокцидиоза;

4. Конидиоспоры – возникают на дифференцированных конидиофорах (конидиеносцах) или располагаются по бокам и на концах любой ветви грибницы, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой (споротрихумы). Конидиеносцы состоят из веточек первичного, вторичного или третичного порядка. На продолговатом или расширенном конце конидиеносца располагаются более короткие столбики (стеригмы), от которых отпочковываются характерные для данного вида конидии, располагающиеся цепочками, придавая конидиеносцу вид кисточки. Форма конидий круглая или овальная, реже грушевидная, стенка бесцветная или темноокрашенная. Конидии развиваются на воздушном мицелии, который за счет этого становится мучнистым и пигментированным. Конидиоспоры характерны для аскомицетов;

5. Спорангиоспоры – они располагаются на вершине спорангиеносца в специальных органах – спорангиях. Они являются эндоспорами и при разрыве стенки спорангия, попадая в благоприятные условия, прорастают, образуя мицелий. Спорангиоспоры наблюдаются у мукоровых грибов.

Рис. 26. Неполовое размножение грибов, морфология спор. а – бластоспоры; б – интеркаларные (промежуточные) и терминальные (концевые) хламидиоспоры; в – артроспоры; г – конидии аспергилла; д - конидии пеницилла; е – конидии споротрихума; ж – алейрии; з – спорангии с эндоспорами у мукора; и – сферулы кокцидоидного гриба (Кашкин Н.П., 1979).

Половое размножение обнаружено у патогенных грибов классов Ascomycetes и Zygomycetes (рис. 27), при этом образуются следующие разновидности спор:

1. Аскоспоры – образуются в сумках (асках), развивающихся в специальных плодовых телах – аскокарпах дисковидной (апотеции) или сферической формы (клейстотеции). Количество аскоспор в сумке варьирует от 4 до 16 и больше. Размеры аскоспор варьируют от 2-50 мкм. Они имеют цилиндрическую, веретенообразную, лимонообразную или чечевицеподобную форму. Свойственны сумчатым грибам – аскомицетам;

2. Зигоспоры – у некоторых зигомицетов, верхушки расположенных близко к друг другу гиф сливаются, происходит мейоз, и образуются крупные зигоспоры с толстыми стенками;

3. Базидиоспоры – после мейоза на поверхности особой клетки, называемой базидиумом, на вершине каждой из четырех стеригм развивается по одной круглой или удлиненной базидиоспоры, что характерно для базидиомицетов.

Рис. 27. Половые споры грибов. А – зигоспоры; б – аскоспоры; в - базидиоспоры (Кашкин Н.П., 1979).

Как уже отмечалось, кроме гифальных форм грибов существуют и бластомицеты (дрожжевые и дрожжеподобные грибы). Они представляют собой сферические, овоидные или грушевидные формы размером 3-15 мкм. Эти клетки содержат включения гликогена, волютина, липиды, они способны к почкованию, бинарному делению, в результате которого клетки не распадаются, а образуют псевдомицелий.

Для многих видов грибов может быть характерен диморфизм, то есть гифальная форма роста может переходить в дрожжеподобную, что чаще наблюдается в пораженных тканях человека (например, возбудители гистоплазмоза и бластомикоза).

Ни один из вышеописанных выше морфологических элементов не является характерным для того или иного гриба. Комплексом разнообразных клеточных элементов определяется большой полиморфизм грибов в культурах на различных питательных средах. Тканевые формы грибов обычно представлены довольно однообразными спорами или мицелием, совсем не похожими на культуральные элементы грибов.

Классификация грибов разработана недостаточно, в основе лежит морфоструктурная организация и способ размножения. Заболевания (микозы) у человека вызывают около 500 видов грибов. Их принято называть паразитическими или патогенными грибками. Различают следующие классы, содержащие патогенные формы грибов:

1. Zygomycetes – зигомицеты. Мицелий несептированнный, многоядерный. Имеют особый тип полового процесса – зигогамию, представляющую слияние недифференцированных на гаметы клеток. Образующаяся зигоспора покрывается толстой оболочкой и прорастает после периода покоя. Бесполое размножение осуществляется спорангиоспорами (эндоспоры) или конидиями (экзоспоры). Споры формируются в спорангиях на верхушке спороносцев. К порядку Mucorales к семейству Mucoraceae относится род Mucor (Mucor mucedo) для которого характерны шаровидные спорангии. Споры гладкие, бесцветные или слабо окрашенные, яйцевидные. Конидии отсутствуют. Головчатая плесень может вызывать у человека поражение легких, среднего уха и общий инфекционный процесс.

2. Ascomycetes – аскомицеты. Сумчатые грибы с многоклеточным септированным мицелием. При половом процессе размножаются аскоспорами (споры развиваются в особых сумках – асках). Бесполое размножение осуществляется конидиями. К порядку Pleotascales к семейству Aspergillaceae относится род Aspergillus (Aspergillus niger, Aspergillus flavus). Конидиеносцы прямостоящие, на концах шаровидное вздутие, несущее стеригмы, расположенные радиально на поверхности всего вздутия (вид струек воды из лейки). «Леечная» плесень у человека вызывает аспергилез легких, уха, глаз и других органов и тканей. Род Penicillium («кистевик») имеет многоклеточные конидиеносцы, которые разветвляются в верхней части и заканчиваются стеригмами, расположенными в виде кисточек. От стеригм отшнуровываются конидии, одноклеточные, круглые или овальные, в массе часто зеленоватого цвета. Строение кисточки у различных видов пенициллов различно, оно положено в основу систематики рода. К семейству Sacharomycetaceae относятся дрожжи (род Sacharomyces) и дрожжеподобные грибы (род Candida). Дрожжевые клетки имеют округлую, овальную или вытянутую форму, размером 8-10 мкм, двухконтурную оболочку. В цитоплазме включения в виде гранул гликогена, волютина, липидов. Размножение почкованием и аскоспорами. Грибы Candida сходны с истинными дрожжами, отличием служит отсутствие аскоспор и способность к образованию псевдомицелия. При образовании псевдомицелия клетки вытягиваются в длину и соприкасаются узким основанием. Они вызывают кандидозы, которые развиваются у больных людей при резком снижении резистентности организма и длительном применении антибиотиков.

3. Класс Deuteromycetes (Fungi imperfecti) – несовершенные грибы имеют многоклеточный мицелий. Бесполое размножение осуществляется конидиями или оидиями, образующимися в результате распада гиф на отдельные клетки. У некоторых дейтеромицетов конидии отсутствуют, и такие виды образуют склероции. Половой процесс отсутствует, весь жизненный цикл проходит в гаплоидной стадии. У некоторых видов установлена связь с аскомицетами и базидиомицетами. Особый интерес представляют возбудители дерматомикозов: фавуса, трихофитии, эпидермофитии, микроспории.

Кроме микозов, грибы могут вызывать микотоксикозы. В настоящее время изучено около 300 видов микотоксинов (афлотоксин, охратоксин, мускарин, лизергиновая кислота и др.) Микотоксины вызывают у человека сильные пищевые отравления, острые гепатиты, они обладают нефротоксичностью, многие из них канцерогенны и тератогенны.

В микробиологической промышленности грибы используются как продуценты органических кислот (лимонной - Aspergillus niger), ферментов (амилаз - Aspergillus oryzae; пектиназ - Aspergillus awanori; каталазы – Penicillium vitale и др.), липидов, антибиотиков (пенициллина – Penicillium notatum; гризеофульвина – Penicillium griseofulvum), а также используются в пищевой промышленности (например, для созревания сыров рокфор и камамбер, получения вина, спирта, при хлебопечении и т.д.).

Методы исследования. Для микроскопического исследования готовят как нативные (неокрашенные), так и окрашенные препараты.

Исследование неокрашенных препаратов

Чтобы яснее различить элементы грибка, производят просветление препарата, для этого патологический материал (корочки, кусочки ногтя, волос, соскобы со слизистых, содержимое гранулематозных очагов) помещают на часовое стекло или чашку Петри, куда наливают 10-15% раствор едкого натрия или калия и ставят в термостат при 37⁰С на 20-30 мин. Затем материал извлекают и помещают в каплю 50% раствора глицерина на предметное стекло и закрывают покровным стеклом, микроскопируют в фазово-контрастном или световом микроскопе. Можно использовать другой метод: на патологический материал наносят каплю глицерина с добавлением 10% едкого калия и исследуют через 4-5 мин, закрыв покровным стеклом.

Гной из абсцессов, содержимое язв, мокроту разбавляют физиологическим раствором или водно-спиртовым (1:1) или 50% водным раствором глицерина, готовят препарат «раздавленная капля» и рассматривают при увеличении х200, х400 используя фазовый контраст.

Исследование окрашенных препаратов

Из гноя, крови, ликвора, осадка бронхиальных смывов и мочи готовят тонкие мазки, которые фиксируют в смеси Никифорова, Карнуа, спирт-формоле, высушивают и окрашивают:

Окраска лактофуксином, содержащим кислого фуксина – 0,1 г, молочной кислоты – 100 мл. Окрашивают в течение 3-5 мин. Фон препарата розовый, мицелий опалесцирует голубым цветом. Хорошо окрашиваются грибы при мукормикозе и аспергилезе.

Окраска лактофенолом. Мазок заливают на 30-60 мин смесью содержащей 2 части глицерина и по 1 части карболовой, молочной кислот и дистиллированной воды. При добавлении 5% раствора синьки грибки окрашиваются в голубой цвет. При этом мазки фиксируются и окрашиваются одновременно.

Окраска по Романовскому-Гимзе. Краску, разведенную в дистиллированной воде (1-2 капли краски на 1 мл воды), наносят на фиксированный смесью Никифорова мазок, и красят 30-60 мин. Промывают водой и высушивают. Окраску применяют при исследовании возбудителей кандидомикоза, гистоплазмоза, криптококкоза. Дрожжевидные клетки окрашиваются в розово-фиолетовый цвет, хроматиновые включения - в красный, волютин – в фиолетовый.

Кроме того, мазки можно окрашивать по Граму, Цилю-Нильсену (модификация Раусона), 1% водным раствором метиленового синего, гематоксилином-эозином, по Мак-Манусу (Шик-реакция).

Для изучения грибков в тканях проводится патогистологическое исследование. Для этого готовят парафиновые или целлоидиновые срезы (толщиной 1-3 мкм), которые окрашивают, обезвоживают, просветляют и заключают в канадский бальзам.