Действие физических факторов на микроорганизмы

Среди физических факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов, наибольшее значение имеет температура. По отношению к существованию в различных температурных режимах микроорганизмы делят на мезофильные формы, оптимальная температура для которых составляет 25-40⁰С. К мезофилам относится подавляющее большинство как сапрофитных, так и патогенных бактерий.

Среди бактерий – обитателей глубин океанов, тундровых почв встречаются сапрофитные бактерии – психрофилы, которые размножаются при температуре ниже 20⁰С. Термофильные микроорганизмы, заселяющие, например, воды горячих источников, способны размножаться при температуре выше 70⁰С.

Бактерии-мезофилы в вегетативном состоянии чувствительны к повышению температуры до 50-55⁰С. При этом происходит денатурация ферментных белков бактериальной клетки, что ведет к гибели организма. Спорообразующие бактерии – бациллы – более устойчивы к повышению температуры, многие из них способны выдерживать в течение нескольких часов нагревание до 100-110⁰. Однако, чувствительность к повышенной температуре колеблется у бактерий в зависимости от условий культивирования, состава питательной среды, длительности экспозиции температурного влияния и других факторов.

При температуре ниже оптимальной на 5-10⁰С бактерии не погибают, однако, их размножение задерживается в связи с торможением обмена веществ. Для сохранения вегетативных форм бактерий при пониженной температуре применяют вещества с высокой вязкостью, которые предохраняют цитоплазму бактериальной клетки от разрушения кристаллами льда. Такие вещества называют криопротекторами. К ним относятся желатина, раствор альбумина, глицерин, 40% раствор сахарозы. Криопротекторы используют для длительного хранения культур бактерий при минусовых температурах, а также при лиофильном высушивании микроорганизмов. Лиофильное высушивание предусматривает переход вещества из замороженного состояния в сухое, минуя жидкую фазу. Это достигается при нагревании замороженных культур бактерий в условиях вакуума и используется при приготовлении иммунобиологических препаратов.

Кроме температурного фактора на бактерии влияют и факторы осмотического и гидростатического давления. Бактерии, дрожжи и плесневые грибы устойчивы к гидростатическому давлению. Они переносят давление 1000-3000 атм, а спороносные бактерии - до 20 000 атм. При таком высоком давлении снижается активность бактериальных ферментов и токсинов. Осмотическое давление отрицательно влияет на биохимическую активность микроорганизмов. Повышение концентрации солей задерживает развитие многих бактерий, однако, есть виды способные развиваться в присутствии концентрированных растворов солей, такие бактерии называют осмофильными (галофильными). Осмотическое давление в клетке регулирует цитоплазматическая мембрана. При высоком осмотическом давлении окружающей среды происходит плазмолиз. Плазмолиз явление обратимое, и если понизить осмотическое давление окружающего микроорганизмы раствора, вода поступает внутрь клетки и возникает явление противоположное плазмолизу – плазмоптиз.

К физическим факторам, влияющим на микроорганизмы, относят также и влияние лучистой энергии. Большинство патогенных бактерий плохо переносят прямой солнечный свет. На этом основано использование ультрафиолетового света с целью обеззараживания (стерилизации) воздуха в помещениях медицинских учреждений. Как УФ-свет, так и рентгеновские лучи, и другие виды ионизирующего излучения оказывают на микроорганизмы летальное или мутагенное действие. Наиболее эффективны короткие лучи ультрафиолетового спектра с длиной волны около 280 нм. Такие лучи поглощаются нуклеиновыми кислотами клетки, при этом поражаются пиримидиновые основания и клетки погибают в результате возникновения летальных мутаций. Часть облученных клеток популяции способна к восстановлению, репарации ДНК. Репарация облученных молекул ДНК происходит при фотореактивации клеток, для этого необходимо воздействовать на клетки повторно лучами более длинноволновой области (520-550 нм) или провести «темновую реактивацию».

Радиоактивное излучение также губительным образом действует на микроорганизмы. При этом значение имеют морфологическое и физиологическое состояние микроорганизма, экспозиция, доза облучения. Бактерии более чувствительны к ионизирующему облучению, чем вирусы. Механизм действия ионизирующей радиации так же связан с изменением нуклеиновых кислот клетки. Ионизирующая радиация в отдельных случаях используется в практике здравоохранения для стерилизации лекарственных веществ, хирургических материалов.

Ультразвуковые волны при частоте колебания 1-1,3 мГц в течение 10 мин оказывает бактерицидный эффект на клетки микроорганизмов. Ультразвук способствует разрыву клеточных стенок и мембран, повреждению флагеллина у подвижных форм микроорганизмов. Влияние ультразвука основано на механическом разрушении микроорганизмов в результате возникновения высокого давления внутри клетки или на появлении гидроксильных радикалов и атомарного кислорода в водной среде цитоплазмы. Это позволяет использовать его в качестве стерилизующего агента, а также применять для инактивации и дезинтеграции вирусов с целью получения антигенов и вирусных вакцин.

 

Методы стерилизации

Почти все факторы физического воздействия на микроорганизмы могут быть использованы с целью стерилизации. Под стерилизацией понимают обеспложивание, освобождение материалов, растворов, питательных сред от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов. Стерильность - понятие абсолютное, оно означает полное отсутствие микроорганизмов, как на поверхности, так и внутри стерильного объекта.

В практике широко используют несколько способов стерилизации: термическая (под действие высоких температур) и холодная (с помощью ультразвука, излучения, фильтрации).

Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в результате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых структур микроорганизмов. Различают следующие способы тепловой стерилизации:

Прокаливание. Это самый старый и надежный способ стерилизации. В пламени горелки прокаливают бактериологические петли, препаровальные иглы, кончики пинцетов и ножниц, предметные стекла. При этом бактерии, грибы и их споры сгорают.

Кипячение. Для стерилизации металлических инструментов, стеклянных изделий, резиновых трубок, пробок используют кипящую воду. При 100⁰С (температура кипящей воды) вегетативные формы микроорганизмов и большинство вирусов погибают быстро, в течение нескольких минут. Споры (бациллы сибирской язвы, ботулизма) выдерживают кипячение в течение нескольких часов, вирусы гепатита В – около часа. Стерилизацию осуществляют в специальных металлических сосудах – стерилизаторах, которые могут быть снабжены электронагревом. Существует большое количество типов стерилизаторов, отличающихся по объему и устройству.

Стерилизация сухим жаром. Для стеклянной посуды чаще всего используют стерилизацию сухим жаром. Ее проводят в специальных суховоздушных (сухожарочных) шкафах, имеющих датчики – регуляторы температуры. Режимы стерилизации включают температуру и время. Наиболее часто используют следующие режимы стерилизации сухим жаром:

 

Температура, ^0С	Время, мин

При таких режимах погибают как вегетативные формы, так и споры микроорганизмов.

Автоклавирование – стерилизация насыщенным паром под давлением. Проводится при температуре выше точки кипения воды. Это наиболее надежный и распространенный способ стерилизации. Особая эффективность этого способа достигается при совместном действии пара и высокой температуры. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся аппаратах с толстыми стенками – автоклавах. Автоклав состоит из стерилизационной камеры, снабженной краном для выхода воздуха, манометром для измерения давления пара, предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления выше необходимого, термометра для измерения температуры внутри камеры. Имеется паровой котел с нагревателем воды. При кипячении воды пар поступает в камеру автоклава. Автоклав герметически закрывают крышкой или дверью с плотной резиновой прокладкой. Автоклавирование проводит специально подготовленный специалист, так как работа по обслуживанию аппарата, работающего под давлением требует подготовки и строгого соблюдения правил техники безопасности. Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени. Избыточное давление в 1 атм устанавливается при достижении температуры в камере 121⁰, 1,5 атм – 125⁰, 2,0 атм – 134⁰. При таких режимах автоклавирования вегетативные формы микроорганизмов погибают в течение нескольких минут, а споры в течение 20-30 мин. Режим стерилизации выбирают в зависимости от свойств стерилизуемого материала. Так, питательные среды стерилизуют 20-30 мин при 1 атм, перевязочный материал и резиновые изделия от 1 до 2 часов при 1,0-1,5 атм. Для контроля режима стерилизации используют вещества с определенной температурой плавления. Их смешивают с метиленовой синью, помещают в ампулы или небольшие флаконы и раскладывают в автоклаве перед началом автоклавирования. К таким контролирующим веществам относятся бензаурин, температура плавления 115⁰, соответствует – 0,5 атм; бензойная кислота, температура плавления 121⁰, соответствует – 1,0 атм; мочевина, температура плавления 132⁰, соответствует – 2,0 атм; глюкоза, температура плавления 146⁰; тиомочевина, температура плавления 180⁰. Эти вещества расплавляются при достижении в сосуде соответствующей температуры и окрашиваются в цвет добавленного красителя.

Стерилизации текучим паром подвергаются те растворы и питательные среды, которые разрушаются при стерилизации под давлением. Такую стерилизацию проводят также в автоклавах при избыточном нулевом давлении и температуре 100⁰. Применяют «дробную стерилизацию» - трех- или четырехкратную обработку с интервалом в 1 сут, во время которого не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы и погибают от действия пара и температур.

Пастеризация предусматривает уничтожение в материале только вегетативных форм микроорганизмов и применяется в пищевой промышленности. При этом используют кратковременное нагревание до 90-92⁰ в течение 2-5 сек или более длительное - в течение 5-10 мин нагревание до 70-75⁰. Обработанные таким образом материалы считаются пастеризованными, но не стерильными, так как содержат споры.

Холодная стерилизация осуществляется в отношении материалов, сред и растворов, которые изменяют свойства при тепловой стерилизации. Стерилизация фильтрованием показана для синтетических сред определенного состава, содержащих термолабильные аминокислоты, витамины, белки, для антибиотиков, ароматических углеводородов. Фильтрование проводится через мелкопористые материалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Диски, изготовленные из асбеста с целлюлозой называют фильтрами Зейтца. Их помещают в специальный фильтродержатель и стерилизуют в автоклаве, а затем, смонтировав держатель с колбой или бутылью, под давлением пропускают стерилизуемый раствор. Широкое применение нашли мембранные фильтры. Их изготавливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Фильтры имеют поры размером от 0,22 до 100 мм. В фильтродержатели монтируют фильтры с разной величиной пор, от больших к меньшим и при фильтрации растворов постепенно «отсеивают» микроорганизмы различных размеров. Наиболее широко известны фильтрующие пластины фирм «Миллипор», «Синпор», «Владипор». После стерилизующей фильтрации среды и растворы обязательно проверяют на стерильность, помещая микропробы простерилизованных растворов в термостат при температуре 37⁰С.