Методы микроскопического исследования

Микроскопия в темном поле расширяет разрешающую способность микроскопа до 0,02 мкм. Ее применяют для изучения неокрашенных живых микробов, их подвижности. Метод основан на освещении объекта косыми лучами света, которые, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза. Поэтому поле зрения выглядит черным, а исследуемые микробные клетки, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи.

Фазово-контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете микроорганизмы прозрачны, мало отличаясь от окружающей среды. При прохождении света через микробную клетку за счет разницы в показателях преломления структур клетки происходит изменение фазы проходящих световых лучей, которое не улавливается глазом человека. Фазово-контрастное устройство переводит невидимые человеческому глазу фазовые изменения пучка света в контрастные (амплитудные), создавая контраст между неокрашенным микроорганизмом и окружающей средой. Устройство комплектуется специальными объективами с фазовыми кольцами, а также специальным фазовым конденсором с револьвером специальных кольцевых диафрагм для каждого объектива.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. Люминесценция - это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией коротковолновой и ультрафи­олетовой части спектра. Микробы обладают слабой первичной люминесценцией, поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами люминесцирующих кра­сителей — флюорохромов (акридин, аурамин, флюоресцеин, корифосфин, родамин и др.), которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, связываясь с определенными клеточными структурами - ядром, оболочкой, цитоплазмой и включениями.

Рис. 23. Люминесцентный микроскоп

Конструктивные особенности люминесцентного микроскопа (рис.23) состоят в наличии мощной осветительной лампы (например, ртутно-кварцевой), а также специальных светофильтров. Возбуждающий люминесценцию синий фильтр, расположен за источником освещения, а «запирающий» фильтр желтого цвета на окуляре служит для отделения флюоресценции от падающего света.

Люминесцентная микроскопия имеет ряд преимуществ перед обычной световой микроскопией, в частности, возможностью исследования живых микроорганизмов, обнаружения их в материале в небольших количествах, наличием цветного изображения.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов.

Длина волны электронных лучей во много раз короче длины световых лучей, что позволяет значительно увеличить разрешающую способность микроскопа, получить большее увеличение и рассматривать объекты, невидимые в световом микроскопе. Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной от 0,01 до 0,1 нм, применяя для изучения структур бактерий, вирусов и фагов.

На пути потока электронов в вакуумной среде помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, действуя подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу, а затем через объективную и проекционные линзы. Картина микроскопируемого объекта отображается на флюоресцирующем экране вследствие неодинаковой проницаемости различных структур исследуемого объекта для электронов.

Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая микроскопия, которая позволяет получить объемное изображение за счет управляемого пространственного перемещения пучка электронов.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Люминесцентная микроскопия. Окраска спор путем прямого флюорохромирования. Методика окраски: препараты, приготовленные из культуры сенной палочки (Bacillus subtilis), обрабатывают водным раствором аурамина в концентрации 1:1000 в течение 2 минут. Затем препарат обесцвечивают 0,5% раствором серной кис­лоты в течение 30 сек. и после промывки докрашивают в течение 1 минуты водным раствором родамина 6ж в концентрации 1:5000. Высушенные препараты просматривают в люминесцентном микроскопе. На фоне красно-кирпичного свечения вегетативных форм бактерий, окрашенных родамином, выявляются овальные, слегка вытянутые споры ярко-зеленого или желтого цвета.

2. Органы подвижности бактерий – жгутики. Изучить демонстрационный препарат культуры протея - Proteus vulgaris, окрашенный серебрением по Морозову. В ходе обработки (разрыхление протравой - танин с фенолом с последующей импрегнацией серебром) жгутики увеличиваются в диаметре, достигая пределов разрешающей способности иммерсионного микроскопа. Окружая тело микроба со всех сторон, они свидетельствуют о принадлежности протея к перитрихам.