Тема 8. Вирусы бактерий (бактериофаги)

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Понятие о бактериофаге, его морфология, химический состав. Классификация фагов.

2. Вирулентные и умеренные фаги, их характеристика.

3. Основные стадии взаимодействия фага с бактериальной клеткой.

4. Трансдукция, фаговая конверсия и их механизмы.

5. Лизогения и методы ее изучения.

6. Распространение фагов в природе. Методы обнаружения, выделения и титрования фагов.

7. Использование фагов в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний.

ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ

Бактериофаги (вирусы бактерий), внедряясь в бактерии, вызывают растворение (лизис) бактерий, что проявляется просветлением засеянной бактериями жидкой среды или образованием зон лизиса («стерильных пятен») на плотных питательных средах. Бактериофаги отличаются специфичностью, поражая определенный вид или вариант (фаговар) бактерий. В естественных условиях фаги в большом количестве встречаются там, где много бактерий (испражнения, почва, сточные воды). Вирулентные (вегетативные) фаги вызывают лизис бактерий, тогда как умеренные (или лизогенные) фаги объединяются с нуклеоидом бактерий и существуют в бактерии в виде профага. Это явление называется лизогенией. Для выделения вирулентного фага из объектов окружающей среды исследуемый материал (суспензия почвы, фекалии) пропускают через бактериальные фильтры, задерживающие микробные клетки. Активность фага определяется его титром (максимальное разведение, вызывающее лизис соответствующих микробных клеток в опытах на плотных или жидких питательных средах).

Бактериофаги применяются для лабораторной диагностики (фаголизабельность и фаготипирование культур бактерий), профилактики и лечения бактериальных инфекций.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Определение коли-фага в фильтрате речной воды (демонстрация). На поверхность пластинчатого МПА «густым га­зоном» засевают культуру кишечной палочки. На посев нано­сят I – 2 капли исследуемого материала – фильтрата. Закрыв чашку Петри крышкой, оставляют посев на столе на 5 минут. За­тем посев ставят на сутки в термостат. В положительном слу­чае в месте нанесения фильтрата наблюдается «стерильное» пят­но.

2. Определение титра коли-фага в жидкой питательной среде по Аппельману (демонстрация). Ряд пробирок содержит по 4,5 мл МПБ. В первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, получая разведение 1:10, затем после перемешивания 0,5 мл материала переносят во вторую пробирку (разведение 1:100) и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл содержимого удаляют. Затем во все пробирки вно­сят по I капле бульонной культуры кишечной палочки и пробирки помещают на 24 часа в термостат. Титр фага определяют по мак­симальному разведению, при котором наблюдается лизис микробов (например 10^-5).

3. Определение титра дизентерийного фага по Грациа (демонстрация). Готовят разведения исследуемого фага от 10^-5 до 10^-7. По 0,5 мл каждого разведения фага смешивают с 0,5 мл бульон­ной культуры дизентерийной палочки (Shigella sonnei). Смесь вно­сят в 3 мл расплавленного и охлажденного до 45⁰ С 5% МПА, пе­ремешивают и выливают на поверхность 3 чашек с МПА. Посевы инкубируют 24 часа в термостате при 37⁰ С. Учитывают количество негативных колоний на единицу объема исходной суспензии фага. Титр фага определяется количеством фаговых частиц в I мл суспензии (табл. 4).

Таблица 4

Расчет титра фага по методу Грациа

Номер пробы	Число «стерильных пятен фага, полученных при посевах проб в разведениях	Число фаговых частиц
10^-5	10^-6	10^-7
1.				7,3х10^7
2.				1,0х10^8
3.				7,7х10^6

 

4. Определение спектра литического действия дизентерийного фага (демонстрация). Чашку с МПА делят на 4 сектора. На каж­дый сектор петлей наносят каплю бульонной культуры Sh.sonnei, Sh.dysenteriae, Sh.flexneri, Sh.boydii соответственно и равномерно распределяют по поверхности агара. Затем на каждый сектор наносят по капле исследуемого фага. После инкубации в термостате в тече­ние суток при 37⁰ С выявляют сектора, где имеется лизис бакте­рий или «стерильные» пятна.

5. Фаготипирование культуры золотистого стафилококка (демонстрация). Бульонную культуру стафилококка в количестве 0,5 мл вносят в расплавленный и охлажденный до 45⁰ С 0,7% МПА, пере­мешивают и распределяют по поверхности чашки с 2% МПА. Чашку делят на квадраты, в которые вносят по капле различных типовых стафилококковых фагов. После инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых имеется лизис бактерий и по таблице определяют фаговар культуры.

6. Определение лизогении культуры возбудителя брюшного тифа (демонстрация). Исследуемую культуру засевают на МПБ, через сутки ее центрифугируют. Надосадочную жидкость, содер­жащую свободный фаг, переносят на посев индикаторной брюшно­тифозной культуры в чашке Петри, инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение суток. Если исследуемая культура лизогенная, на посеве индикаторной брюшно­тифозной культуры обнаруживают «стерильные» пятна.

7. Изучение биопрепаратов фага, применяемые для профилактики и лечения (стафилококковый бактериофаг, коли – фаг, сальмонеллезный бактериофаг, коли-протейный фаг, дизентерийный бактериофаг, протейный фаг, брюшнотифозный бактериофаг, стрептококковый фаг, паратифозный бактериофаг, холерный фаг Эль-Тор, холерный фаг классический)

8. Изучение препаратов фагов, применяемых для диагностики инфекционных болезней (индикаторные фаги - демонстрация).

Тема 9. ГЕНЕТИКА МИКРОООГАНИЗМОВ.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Особенности организации генетического материала у микроорганизмов. Плазмиды бактерий и их характеристика.

2. Модификационная изменчивость у бактерий.

3. Мутации у бактерий, их классификация, механизмы. Процессы репарации у бактерий.

4. Рекомбинационная изменчивость у бактерий. Трансдукция, трансформация, конъюгация и их механизмы.

5. Принципы генетического картирования бактерий.

6. Принципы генной инженерии, аспекты практического применения.

7. Понятие о биотехнологии.

8. Генетический метод диагностики инфекционных заболеваний. Методы молекулярной гибридизации. Полимеразная цепная реакция.

ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ

Генетика микроорганизмов.

Изменчивость у бактерий может носить фенотипический (модификации) или генотипический (мутации) характер.

Модификации представляют собой фенотипические ненаследуемые изменения, возникающие при действии ряда факторов на генетически однородные микроорганизмы.

Мутации характеризуются наследуемыми изменениями в генетическом аппарате микроорганизма и, соответственно, в его биологических свойствах. Спонтанные мутации могут иметь неблагоприятный исход для микроба. Вместе с тем, мутационная изменчивость в сочетании с методами селекции открывает широкие возможности для поиска полезных микроорганизмов. Применение мутагенов позволило получить высокоактивные продуценты антибиотиков и аминокислот. Методами отбора были созданы живые вакцины против полиомиелита, кори, туберкулеза и др.

К рекомбинационным видам изменчивости у бактерий относятся трансформация, конъюгация и трансдукция.

Трансформация – это процесс переноса генетической информации бактерии-реципиенту с помощью ДНК бактерии-донора. Этим генетическим приемом можно передать вирулентность, устойчивость к антибиотикам, способность синтезировать различные вещества и др.

Трансдукция – это процесс переноса генетической информации от бактерии-реципиента клетке-донору с помощью бактериофага, например, способности синтезировать какой-либо фермент.

Конъюгация – процесс, при котором передача генетического материала происходит при непосредственном контакте двух микробных клеток. При этом из бактерии-донора (F+ или Hfr) в бактерию-реципиент переходит F-плазмида (нехромосомный фактор наследственности в виде короткой цепочки ДНК), которая придает бактерии-реципиенту новое свойство, например, устойчивость к антибиотикам, способность продуцировать определенные аминокислоты, белки, факторы роста и т.д. Метод конъюгации создает широкие перспективы для создания рекомбинантных культур микроорганизмов, применяемых для получения лекарственных средств. В настоящее время сконструированы штаммы Е. coli, в геном которых встроены гены, контролирующие синтез интерферона, инсулина, других гормонов. В геном дрожжей введен ген вируса гепатита В, ответственный за выработку иммуногенного HB_sAg, что использовано для производства генно-инженерной вакцины для профилактики этого заболевания.