Действие биологических факторов на микроорганизмы.

Микроорганизмы, обитающие во внешней среде, в организме человека или животных могут сожительствовать между собой (симбиоз). Формами симбиоза являются мутуализм (взаимовыгодный симбиоз), метабиоз (один микроорганизм использует для своих целей продукты жизнедеятельности другого микроорганизма), комменсализм (один микроорганизм извлекает для себя выгоду от другого, не причиняя ему вреда), сателлизм (усиление роста одного вида микроорганизма по влиянием другого).

Антагонистические взаимоотношения или антагоностический симбиоз выражается в виде неблагоприятных эффектов одних микроорганизмов на другие. Антагонизм проявляется в виде подавления роста бактерий (бактериостатические эффекты) или растворения, гибели бактерий (бактериолитические, бактерицидные эффекты), что может быть связано с прямым влиянием микробов друг на друга или неспецифическим действием антимикробных продуктов обмена бактерий (кислоты, щелочи, спирты, перекиси, сероводород, аммиак, антибиотики, бактериоцины и др.). Явление антагонизма широко применяется в практических целях для поиска и создания антибиотиков.

Понятие о химиотерапии. Химиотерапия – специфическое антимикробное и антипаразитарное лечение с помощью химических веществ. В группу антибактериальных химиотерапевтических средств входят сульфаниламиды, нирофурановые препараты, оксихинолины, хинолоны, имидазолы, противотуберкулезные препараты. Созданы также противопаразитарные, противогрибковые и противовирусные (ацикловир, ремантадин, рибавирин и др.) химиотерапевтические препараты. Среди химиопрепаратов особое место занимают антибиотики.

Антибиотики действуют на микроорганизмы избирательно, тогда как антисептики и дезинфицирующие вещества являются цитоплазматическими ядами для всех живых клеток. Каждый антибиотик имеет свой спектр антимикробного действия – узкий или достаточно широкий, действуя как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии.

Антибиотики отличаются по механизмам действия (способны инактивировать ферменты, нарушать процессы обмена веществ, рост и размножение определенных видов микробов), источникам получения, химической структуре.

В зависимости от источника получения различают 5 групп антибиотиков:

1. антибиотики, полученные из грибов (пенициллины, цефалоспорины);

2. антибиотики, полученные из актиномицетов (стрептомицин, эритромицин, левомицетин, нистатин и др.);

3. антибиотики, продуцентами которых являются бактерии (полимиксины);

4. антибиотики животного происхождения (эктерицид);

5. антибиотики растительного происхождения (фитонциды, в чистом виде не выделены, т.к. являются нестойкими соединениями).

В зависимости от химической структуры выделяют 8 групп антибиотиков:

1. β –лактамы (пенициллины, цефалоспорины и др.);

2. макролиды (эритромицин, олеандомицин и др.);

3. аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, гентамицин, амикацин и др.);

4. тетрациклины (окситетрациклин, метациклин и др.);

5. полипептиды (полимиксины и др.);

6. полиены (нистатин, амфотерицин В и др.);

7. анзамицины (рифампицин и др.);

8. дополнительный класс (левомицетин, линкомицин и др.).

В настоящее время получены синтетические антибиотики (например, левомицетин), а путем частичного изменения химической структуры природного антибиотика - более эффективные полусинтетические антибиотики (например, пенициллины, устойчивые к кислой среде желудка и к действию пенициллиназы, содержащейся у пенициллиноустойчивых штаммов бактерий).

Антибиотики широко применяются для эффективного лечения многих инфекционных заболеваний. Однако в некоторых случаях антибиотикотерапия может приводить к развитию ряда тяжелых осложнений.

В частности, применение больших доз некоторых антибиотиков способно оказать токсическое действие на организм больного (например, стрептомицин может поражать орган слуха и вестибулярный аппарат, тетрациклины — печень, левомицетин — кроветворные органы). Нередко на фоне антибиотикотерапии возникают различные аллергические осложнения (наиболее часто в виде аллергических сыпей, дерматитов, и т.д.), изменения в нормальной микрофлоре различных биотопов, в результате чего развиваются вторичные инфекции, вызванные антибиотикорезистентными штаммами условнопатогенных микробов аутомикрофлоры (кишечная палочка, стафилококк, кандида и др.). Нарушение состава нормальной микрофлоры вплоть до полного исчезновения некоторых ее представителей, обладающих витаминобразующей способностью, приводит к гипо- и авитаминозам.

При действии на микробы недостаточных доз антибиотика микробы могут приобретать к нему или нескольким препаратам (множественная лекарствен­ная устойчивость) выраженную устойчивость. Лекарственноустойчивые формы микроорганизмов встречаются часто, в связи с чем выбор антибиотика для лечения инфекции должен быть сделан после выделения ее возбудителя и определения антибиотикорезистентности.

Активность большинства антибиотиков определяется микробиологическими методами с использованием тест-культур микроорганизмов. Биологическая активность антибиотиков выражается в единицах действия (ЕД); за 1 ЕД принимают минимальное количество препарата, задерживающее рост стандартного штамма микроорганизма в соответствующих условиях.

Для определения чувствительности микроба к антибиотикам разработан ряд методов, среди которых наиболее простым, быстрым и доступным для микробиологических лабораторий является метод бумажных дисков.

Исследуемую культуру засевают на чашку Петри со специальными плотными питательными средами (среды АГВ, Хинтона-Мюллера), на поверхность которого помещают бумажные диски с различными антибиотиками, диффундирующими из диска в агар. В зависимости от степени чувствитель­ности микроба к антибиотику вокруг диска образуется различная по величине зона задержки роста (рис. 32, см. приложение).

Более точным является метод серийных разведений. Навеску антибиотика разводят до содержания 1 мкг в 1 мл - основной раствор, из которого готовят ряд двойных разведений антибиотика в бульоне, после чего в пробирки вносят исследуемую культуры. Учет результатов производят через 18—24 ч пребывания пробирок в термостате по отсутствию роста.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

I. Изучение микрофлоры кожи. а) Исследование смывов с поверхности кожи рук. Стерильным тампоном, смоченным в среде Кесслера (пептонная вода с лактозой, желчью и генциан-виолетом), делают смывы с обеих рук, протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства, тампон помещают в среду Кесслера, инкубируют в термостате при 37⁰ С 24 часа. б) посевы-отпечатки пальцев на сектора чаш­ки со средой Левина. Учет результатов посевов будет выполнен на следующем занятии.

2. Изучение микрофлоры полости рта. Приготовление мазка из зубного налета. Окраска по Граму или по Бурри. Препарат промикроскопировать и зарисовать.

3. Исследование микрофлоры зева. Произвести отбор материала из зева с помощью тампона, приготовить мазок, окрасить по Граму, промикроскопировать. Микрокартину зарисовать.

4. Изучение микрофлоры кишечника (демонстрация). Из исследуемых фекалий готовят разведения 10 ^-2, 10^-4, 10^-6 и т.д. По 0,1 мл каждого разведения засевают на среды Эндо, кровяной, желточно-солевой агар, среды Сабуро, Блаурокка (печеночный агар с лакто­зой и цистином), другие питательные среды и инкубируют при 37⁰ С. Подсчитывают число выросших колоний и определяют число КОЕ в 1 г материала. Проводят отсев 2—3 колоний каждого вида для выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов по биохимическим свойствам. Содержание микрофлоры кишечника в колониеобразующих единицах (КОЕ) у здорового человека представлено в таблице 5. На основании учета демонстрационных посевов сделать выводы о состоянии микробиоценоза кишечника обследованного пациента.

5. Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведении (демонстрация). Метод применяют для определения минимальной подав­ляющей концентрации (МПК) — наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бак­терий. Для этого готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом, буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовле­ния 2-кратных серийных разведений антибиотика (от 1 до 128 ед/мл) в питатель­ной среде — бульоне (в объеме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плот­ности и засевают по 0,1 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль куль­туры). Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 20—24 ч или более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подав­ляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.

6. Микротест-системы для определения чувствительности к ан­тимикробным препаратам (демонстрация) предназначены для быстрого определения клинической чувствительности бактерий к антибиотикам, которые в 2 стандартных концентрациях (средней терапевтической и

 

Таблица 5.

Содержание микрофлоры кишечника здорового человека в норме (КОЕ/грамм фекалий)

 

Наименование представителей	КОЕ
Бифидобактерии	10^8- 10^10
Лактобактерии	10^6 -10^9
Бактероиды	10^7 -10^9
Пептококки и пептострептококки	10^5 - 10^6
Эшерихии	10^6 -10^8
Стафилококки (гемолитические, плазмокоагулирующие)	10^3
Стафилококки (негемолитические,. коагула­зоотрицательные)	10^4-10^5
Стрептококки	10^5 - 10^7
Клостридии	10^3 - 10^5
Эубактерии	10^9- 10^10
Дрожжеподобные грибы	10^3
Условно-патогенные энтеробактерии, неферментирующие грамотрицательные палочки	10^3

мак­симальной) находятся в лунках пластиковых планшетов. Мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) исследуемую чистую культуру вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, приготовленную бактериальную суспензию разлива­ют в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в при­сутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма при­водит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельнос­ти микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.

7. Определение клинической чувствительности бактерий к анти­микробным препаратам методом дисков (диффузионный тест) - демонстрация. Метод основан на подавлении роста бактерий на плотной питательной среде под действием строго определенной концентрации антибиотика, содержащегося в стандартном бумажном диске. Препарат, диффундируя в агар создает вокруг диска градиент концентрации антибиотика с формированием зоны задержки роста, размер которой зависит от чувствительности бактерии и свойств антибиотика. Содержание пре­парата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений минимальных подавляющих концентраций для патоген­ных бактерий. Исследуемую бактериальную культуру, суспендированную в физиологическом растворе, засе­вают газоном в чашки Петри на специальные питательные среды (Мюллера-Хинтон или АГВ, не препятст­вующих диффузии антимикробных веществ и не оказывающих на них отрицательного действия), на поверхность которых накладывают диски с антибиотиками. Посевы инкубируют 18—20 ч при 37⁰ С. Учет резуль­татов осуществляют путем измерения диаметра зоны полной задержки роста. Вывод о чувствитель­ности бактерий к антибиотикам осуществляют с учетом специально разработанных критериев (таблица 6).

8. Количественное определение чувствительности бактерий к ан­тимикробным препаратам с помощью Е-теста. Е-тест является вариантом диффузионного метода, позволяющим оп­ределять МПК антибиотика. Для этого вместо индикаторных дисков с антибиотиками используют особые полимерные полоски, содержащие иммобилизован­ные антимикробные препараты в виде непрерыв­ного градиента концентраций от 0,016 до 256 мкг/мл. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении по­лоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствую­щего шкале. После инкубации посева вокруг полоски образу­ется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные кри­терии.

Таблица 6

Интерпретация значений диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (среда АГВ)

 

Противомикробные препараты в диске	Диаметр зон или культур в мм
Устойчивых	Промежуточных	Чувствительных
Бензилпенициллин для стафилококков	<20	21-28	>29
Бензилпенициллин для др. бактерий	<10	11-16	>17
Ампициллин для стафилококков	<20	21-28	>29
Ампициллин для Грам (-) бактерий	<9	10-13	>14
Карбенициллин 2.5 мкг	<14	15-18	>19
Карбенициллин 100 мкг (для.aeruginosa)	<11	12-14	>15
Оксациллин 10 мкг	<15	16-19	>19
Оксациллин 1 мкг	<10	11-12	>13
Азлоциллин (для P.aeruginosa)	<13	14-16	>17
Цефалотин	<14	15-18	>19
Цефазолин	<14	15-18	>19
Цефуроксим	<14	15-18	>19
Цефокситин	<14	15-18	>19
Цефотаксим	<14	15-18	>19
Цефтриаксон	<14	15-18	>19
Цефоперазон	<14	15-18	>19
Цефтазидим	<14	15-18	>19
Цефалексин	<14	15-18	>19
Цефаклор	<14	15-18	>19
Цефиксим	<15	16-19	>20
Ванкомицин для энтерококков	<14	15-16	>17
Ванкомицин для стафилококков	<11	-	>12
Фузидин	<16	17-20	>21
Линкомицин	<19	20-23	>24
Клиндамицин	<14	15-20	>21
Олеандомицин	<12	13-17	>18
Эритромицин	<17	18-21	>22
Азитромицин	<13	14-17	>18
Тетрациклин	<16	17-21	>22
Доксициклин	<15	16-19	>20
Левомицетин	<15	16-18	>19
Рифампицин	<12	13-15	>16
Полимиксин	<11	12-14	>15
Стрептомицин	<16	17-19	>20
Канамицин	<14	15-18	>19
Неомицин	<12	13-16	>17
Гентамицин	<15	-	>16
Тобрамицин	<14	-	>15
Сизомицин	<15	-	>16
Амикацин	<14	15-16	>17
Нетилмицин	<12	13-14	>15
Фурадонин	<15	16-18	>19
Фурагин	<15	16-18	>19
Ципрофлоксацин	<15	16-20	>21
Азтреонам	<15	16-21	>22
Пиперациллин (для P.aeruginosa)	<17	-	>18
Офлоксацин	<12	13-16	>17
Рокситромицин	<14	15-18	>19
Кларитромицин	<13	14-17	>18
Цефамандол	<14	15-17	>18
Цефепим	<14	15-17	>18
Имипинем	<13	14-15	>16
Мероменем	<13	14-15	>16
Налидиксовая кислота	<12	13-17	>18

 

Педиатрические аспекты темы

1. Возрастные особенности микрофлоры человека. Динамика микро­флоры кишечника у новорожденных детей. Влияние естественного и искусственного вскармливания на характер микрофлоры кишечника ребенка.

2. Применение бактериальных препаратов для профилактики дисбактериоза и лечения кишечных заболеваний у детей.