Тема 6. Физиология бактерий. Ферменты бактерий. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Ферменты бактерий и их классификация Значение изучения ферментативной активности бактерий для определения их видовой принадлежности.

2. Практическое использование бактериальных ферментов.

3. Белковый, углеводный, липидный и минеральный обмены у бактерий.

4. Пигментообразование у бактерий. Значение пигментов в жизне­деятельности бактерий и для идентификации микроорганизмов.

5. Характеристика L-форм бактерий.

ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ

Ферменты бактерий и методы их определения

Ферменты микроорганизмов являются белками - катализаторами химических реакций, происхо­дящих в организме. В микробиологической практике определение ферментов используют для идентификации микроорганизмов, т.к. каждый микробный вид характеризуется определенной биохимической активностью.

Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом, наблюдая через 3—5 дней разжижение желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. В присутствии сероводорода полоска бумаги, пропитанная раствором ацетата свинца, чернеет. Для определения аммиака используют лакмусовую бумажку.

Важным признаком многих микроорганизмов является способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого свойства бактерий используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.) и индикаторы (например, реактив Андреде, меняющий свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5), поэтому эти среды нередко называют «пестрым» или «цветным» рядом. Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают стеклянные поплавки или используют полужидкие среды. Сбраживание лактозы в молочных средах определяют по их свертыванию или изменению цвета лакмусового индикатора, а также при пептонизации.

При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин (промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты). Для этого к 3 мл культуры микроорганизмов на среде Кларка добавляют 1 мл свежеприготовленного 10% спиртового раствора α-нафтола и 1 мл 20% водного раствора гидроксида калия. При наличии ацетоина СНзСНОН СОСН₃ жидкость приобретает красную окраску, что свидетельствует о бутандиоловом брожении.

Каталаза - фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода, содержат аэробы и факультативные анаэробы, но не анаэробы. Для обнаружения фермента небольшое количество исследуемой культуры эмульгируют в капле перекиси водорода, наблюдая выделение пузырьков кислорода.

Определение цитохромоксидазы (фермента, обеспечивающего перенос электронов на атом кислорода в процессе анаэробного дыхания) проводят при дифференциации энтеробактерий, применяя смесь 1% спиртового раствора β–нафтола и 1% водного раствора N-диметил-парафенилендиамина дигидрохлорида, смешанных в соотношении 2:3. На полоску фильтровальной бумаги, смоченной этим реактивом, наносят петлей культуру микроорганизмов. При наличии фермента через 2-5 мин полоска окрашивается в синий цвет.

Важным биохимическим свойством у ряда микробов является их способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для определения нитритов используют реактив Грисса, который готовят из 2 растворов: (первый - 0,5 г сульфаниловой кислоты, растворенной в 30 мл ледяной уксусной кислоты, с последующим добавлением 100 мл воды; второй - 0,1 г нафтиламина, растворенного в 100 мл кипящей воды, с последующим добавлением 30 мл ледяной уксусной кислоты). Оба раствора смешивают в равных объемах, 0,1 мл реактива добавляют в культуру бактерий. Окрашивание культуры в красный цвет указывает на присутствие нитритов.

Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и изменению реакции среды в щелочную сторону (с pH 7,2 до 8,8, при этом среда приобретает пурпурно-красный цвет).

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Выделение чистой культуры аэробов (продолже­ние, начало смотрите на предыдущих занятиях).

Изучить культуру на скошенном МПА. Для проверки чистоты культуры вначале оценивают характер роста визуально, делают мазок и окрашивают его по Граму. Следует просмотреть несколь­ко полей зрения, активно передвигая препарат в разных направлениях. Если культура чистая, ее засевают на короткий "пестрый" ряд (среды Гисса) с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, а также на МПБ. Техника посева: в левую руку помещают одновременно две пробирки наклонно с пробками на одном уровне; пробирка с куль­турой на скошенном МПА находится ближе к нам, а вторая, со средой, куда будет пересеваться культура, располагается кнаружи. Бактериологическая петля стерилизуется в пламени спиртовки, мизинцем правой руки открывают обе пробки сразу, вводят петлю в пробирку с культурой на скошенном МПА, берут культуру бактериологической петлей и пере­носят в засеваемую среду. Закрывают пробками обе пробирки одновре­менно, правой рукой ставят в штатив засеянную пробирку и за­меняют ее следующей пробиркой пестрого ряда. Последовательно культурой со скошенного МПА засевают все пробирки «пестрого» ряда и МПБ.

Для определения протеолитических свойств бактерий производят посев культуры на пептонную воду с целью обнаружения продуктов расщепления пептона: аммиака, индола, сероводорода.

Реакции на аммиак и сероводород. После посева культуры на пептонную воду узкую полоску лакмусовой бумаги для обнаружения аммиака и по­лоску фильтровальной бумаги для обнаружения сероводорода, пропи­танную ацетатом свинца, укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой.

Реакция на индол (способ Эрлиха). После посева культуры в пробирку прибавляют 2 - 3 мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько ка­пель реактива Эрлиха (спиртовой раствор параметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). При наличии индола наблюдается окрашивание среды в розовый цвет.

Пробирки подписывают в соответствии с инициалами студента или номером по списку группы, помещают в штатив, а затем в термостат. Резуль­таты работы заносят в протокол. Работа по выделению чистой культуры аэробов будет закончена на следующем занятии.

2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий из почвы (де­монстрация).

· изучение характера роста культур анаэробов в столбике МПА (для анаэробов характерно образование дисковидных колоний или колоний в виде клочков ваты, газообразование);

· для выделения чистой культуры анаэробов пробирку со столбиком МПА прогревают над спиртовкой, столбик агара переносят в сте­рильную чашку Петри. Изолированную колонию петлей засе­вают в среду Китт-Тароцци;

· изучение характера роста анаэробных бактерий в трубках Вейон-Виньяля (демонстрация);

· учет биохимических свойств различных видов патогенных анаэробов на средах Гисса с углеводами: отмечают фермен­тацию углеводов, газообразование; результаты заносят в протокол № 2.

Учет характера роста возбудителя газовой гангрены (Clostridium perfringens) на среде Вильсон-Блера и на молоке (демонстрация). Среда Вильсона-Блера состоит из МПА, глюкозы, хлористого железа. Возбудитель газовой гангрены восстанавливает сернисто-кислый натрий до сульфида натрия, который вступает в реакцию с хлор­ным железом, переводя его в сернистое железо, имеющее черный цвет. Разрывы питательной среды объясняются образованием газа при расщеплении глюкозы. Молоко быстро свертывается, при этом образуется пористый сгусток, выделяются пузырьки газа, среда просветляется. Изменения на указанных средах наступают быстро - через 3-6 часов.

3. Изучение характера роста Proteus vulgaris. Ha скошенном МПА (посев по Шукевичу). Окончание работы, начатой на предыдущем занятии. Наблюдается подвижность бактерий протея в препа­рате "раздавленная капля" (самостоятельная работа). Дать заключение по результатам исследования.

 

Тема 7. ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВА­НИЯ. ИТОГОВОЕ ЗАНЯТИЕ ПО ТЕМЕ "МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ»

Самостоятельная работа студентов.

I. Окончание бактериологического исследования по выделе­нию аэробов из смеси бактерий. Проводится идентификация бактерий – определение их видовой принадлежности на основании изучения наиболее важных фенотипических свойств данного микроорганизма. К основным видовым признакам бактерий относятся:

· морфологические и тинкториальные свойства;

· культуральные свойства – особенности роста микроорганизмов на питательных средах;

· биохимические свойства – наличие у бактерий характерных для данного вида ферментов;

· наличие видовых антигенов;

· чувствительность к видовым бактериофагам;

· продукция определенных факторов патогенности;

· видовая резистентность к химиопрепаратам и антибиотикам.

В последние годы для видовой идентификации бактерий используются биохимические методы (газожидкостная хроматография с целью идентификации бактерий по составу жирных кислот, а также молекулярно-генетические методы, в том числе рестрикционный анализ, гибридизация ДНК, и наиболее часто -полимеразная цепная реакция).

Самостоятельная работа студентов заключается в учете ферментативной активности выделенной культуры. Почернение одной из индикаторных бумажек свидетельствует о выделении сероводорода, покраснение другой - о выделении индола. Применяемый в сре­дах Гисса индикатор ВР (смесь водно-голубого красителя и розоловой кислоты) в кислой среде имеет синюю окраску, в щелочной среде - красную. В средах пестрого ряда отмечают образование кислоты или щелочи, выделение газа, подвижность. С уче­том всех изученных свойств чистой культуры (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических) формулируется заключение о виде выделенного микроорганизма.

2. Ознакомиться с индикаторными бумажными системами (ИБС) для определения ферментативной активности бактерий.

3. Окончание работы по выделению чистой культуры анаэробов из почвы (учет биохимических свойств). Сделать заключение о виде возбудителя.

4. Контроль теоретических знаний (тестовый контроль, опрос) и практических навыков (микроскопия контрольных микропрепаратов с использованием иммерсионной системы и описанием морфологии микроорганизмов) по разделу: «Морфология и физиология микроорганизмов».