Молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов

Эти методыосновываются на анализе нуклеиновых кислот микроорганизмов.

1. Рестрикционный анализ. Сущность метода заключается в обработке ДНК рестрикционными ферментами (специфическими эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. После этого анализируют полученные фрагменты, специфические для каждого вида или варианта микроорганизма.

2. Гибридизация ДНК. Метод основан на определении уникальных последовательностей генома микроорганизма, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью меченых ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновых зондов, представляющих однонитевые фрагменты ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Основной областью применения является идентификация трудно культивируемых или медленно растущих микробов (например, представителей родов Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter ). Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные (специфические) участки ДНК, находящиеся в исследуемом образце в очень малых количествах. Сущность ПЦР основана на амплификации (увеличении) числа копий искомого участка генома микроорганизма, причем для идентификации вида микроорганизма теоретически достаточно одной копии искомой уникальной последовательности. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя короткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарными концам известного уникального фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фрагмент. Образец многократно (20-40 раз) нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и охлаждают для повторной гибридизации праймеров с комплементарной матрицей, при этом каждая копия участка ДНК становится новой матрицей для синтеза следующей копии. Количество копий искомого фрагмента генома в результате амплификации в специальном приборе – амплификаторе (рис. 27, см. приложение) экспоненциально увеличивается. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов. Определение амплифицированной ДНК осуществляется либо электрофорезом в геле с помощью специального оборудования (рис. 28, см. приложение) с последующим окрашиванием пробы флюоресцентным красителем и регистрацией результатов электрофореза в приборе – трансиллюминаторе (рис. 29, см. приложение), либо флюориметрическим методом (в этом случае зонды и/или праймеры имеют флюоресцентную метку, которая учитывается на приборе- флюориметре – рис 30, см. приложение).

ПЦР широко используется в диагностических целях. Достоинства ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний заключаются в следующем:

1. ПЦР дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры.

2. Метод обладает очень высокой чувствительностью (от нескольких до одного возбудителя в пробе) и 100% специфичностью. Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров.

3. Исследуемый материал может быть дезинфицирован с помощью химических или термических методов, что исключает инфицирование персонала в процессе проведения ПЦР.

1. Простота исполнения, возможность полной автоматизации, быстрота получения результатов (4-5 часов) позволяет отнести ПЦР к экспресс-методам диагностики.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Опыт по выявлению д ействия низких концентраций фенола на подвижность бактерий (модификационная изменчивость). Подвижную культуру P.vulgaris засевают по методу Шукевича на скошенный агар с добавлением 1% фенола. Через сутки инкубации в термостате при 37⁰С выполняют пересев по методу Щукевича на скошенный агар. Демонстрация: среда № 1 - посев исходной культуры протея. Наблюдается ползучий рост по всей скошенной поверхности - культура подвижна. Среда № 2 - с добавлением фенола - рост только в точке нанесения культуры (культура неподвижна). Среда № 3 - пересев со среды с фенолом на среду без фенола - рост по всей скошенной поверхности (культура подвижна). Произошла реверсия признака. Делается вывод о модификационном характере изменчивости протея.

2. Изучение характера роста S (E.coli) и R (B. cereus) форм бактерий на плотной и жидкой питательных средах (демонстрация).

3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий).

Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 10⁸ бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО₄ и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона и инкубируют при 37⁰ С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 10²—10⁵ по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.

На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные ко­лонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концент­рацией антибиотика, являются к нему резистентными. Параллельно делают контрольные посевы.

4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм кишечной палочки - Escherichia coli Str^s, донором - ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Str^r , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл).

К 1 мл бульонной культуры E.coli добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10^–5 – 10^-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 37⁰ С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма .

Опыт специфической трансдукции (демонстрация). Реципиентом является штамм Е. coli lac^-, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного - красные колонии с металлическим блеском.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 10⁶—10⁷ бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 37⁰ С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 10⁶ делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.

6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu⁺ Str^s. Реципиент—штамм E. coli K12F^- leu^- Str^r. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10^–2 - 10^-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают штаммы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селектив­ную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37⁰ С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

7. Учет ПЦР при уреаплазмозе (демонстрация, рис. 31).

 

Клиническая проба	Отрицательная проба	Mycoplasma genitalis	Ureaplasma urealyticum	Mycoplasma hominis	Длина нук­леотидных пар
Рис. 31. Разделение в агарозном геле продуктов амплификации фрагментов генов микоплазм.0 –длина нуклеотидных пар, 1 – Mycoplasma hominis – положительный контроль, 2 – Ureaplasma urealyticum – положительный контроль, 3 Mycoplasma genitalis –– положительный контроль, 4 ––отрицательный контроль, 5 – клиническая проба, положительная на Ureaplasma urealyticum