Методы оценки иммунного статуса организма человека.

А. Определение специфических антител к микробным антигенам, аутоантигенам, аллоантигенам, аллергенам.

Б. Иммунохимические исследования: к оличественная и качественная оценка иммуноглобулинов, их фрагментов, иммунных комплексов в плазме и биологических жидкостях, определение цитокинов и растворимых рецепторов для цитокинов в плазме и биологических жидкостях, продуктов эффекторных клеток и воспалительных реакций, компонентов комплемента, белков острой фазы, других белков.

В. Клеточные исследования. Определение субпопуляций лимфоцитов и фенотипических маркеров, характеризующих изменение функционального состояния клеток, клональности лимфоидных клеток, функциональной активности лимфоцитов in vitro, пролиферативного ответа, продукции иммуноглобулинов, определение цитотоксичности лимфоцитов и других эффекторных клеток, оценка функциональной активности макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, базофилов, эозинофилов.

Г. Иммуногистологические исследования.

Д. Иммуногенетические исследования: HLA-типирование с помощью серологической и молекулярно-биологической технологии, фенотипическое и генотипическое определение аллотипов сывороточных белков, пренатальная диагностика и наследование генетически детерминированных дефектов иммунной системы.

Набор методов для первичного скрининга иммунной системы (тесты 1-го уровня) включает определение популяций и субпопуляций лимфоцитов по кластерам дифференцировки (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-16 – естественные киллеры, CD-19 – В-клетки и т.д.) методами цитофотометрии или иммунофлюоресцентного анализа, определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G с помощью метода радиальной иммунодиффузии по Манчини или нефелометрическими методами, уровня циркулирующих иммунных комплексов спектрофотометрическим методом, показателей фагоцитоза. Эти исследования позволяют выявить нарушения в основных звеньях иммунитета (гуморальном, клеточном, фагоцитарном). Уточняющие методы (тесты 2-го уровня), требующие специальной аппаратуры, реактивов и обученного персонала, позволяют оценить функции клеток иммунной системы, вспомогательных клеток, продукцию цитокинов и т.д. Для объективизации и стандартизации данных иммунологических исследований используется специальная аппаратура (иммуноферментные анализаторы, спектрофотометры и фотоэлектроколориметры, счетчики радиоактивности, лазерные нефелометры и проточные цитофлюориметры, хемилюминометры).

В частности, определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится с помощью автоматического подсчета клеток с использованием специального прибора - проточного цитофлюориметра (рис. 41, см. приложение). Для этого образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель, содержащих только одну клетку, проходящую перед лазерным лучом. При попадании лазерного луча в клетку происходит его отклонение, а также свечение поверхностного антигена клетки в результате его соединения с соответствующим флюоресцирующим моноклональным антителом. Фотоумножитель проточного цитофлюориметра регистрирует оба сигнала, при этом светорассеяние дает информацию о размерах и гранулярности клетки, а флюоресценция - о количестве связанных клеткой меченых антител, позволяя судить об экспрессии поверхностных маркеров. При исполь­зования двух разных моноклональных антител, конъюгированных с разными флюорохромами (например, флюоресцеина, дающего зеленое свечение, и фикоэритрина, обладающего красным свечением), клетки оцениваются по интенсивности зеленого и красного типов флюоресценции.

Оценка иммунного статуса организма человека при различных патологических состояниях имеет важное практическое значение для диагностики, лечения, прогнозирования, оценки эффективности проводимой терапии при многих заболеваниях. Иммунограмма здорового человека представлена в таблице 11.

Иммунотропные препараты для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями иммунной системы, подразделяются на следующие группы:

· иммуномодуляторы – лекарственные средства, восстанавливающие функции иммунной системы;

· иммунокорректоры – иммуномодуляторы точечного действия, нормализующие конкретное нарушенное звено иммунной системы (фагоцитарное, клеточное, гуморальное);

· иммуностимуляторы – лекарственные препараты, усиливающие функции иммунной системы;

· иммунодепрессанты – средства подавляющие иммунную систему.

Классификация и краткая характеристика иммунотропных препаратов представлена в таблицах 12,13.

Таблица 11. Иммунограмма здорового человека

Показатели	Норма	Показатели	Норма
СD3^+ (Т-лимфоциты) %%	50-80	НLА-DR^+ %%
СD3^+ (Т- лимфоциты) кл/л	1000-2200	НLА-DR^+ кл/л	300-600
СD4^+ (Т-хелперы) %%	30-60	IgG г/л	9,0-16,0
СD4^+ (Т-хелперы) кл/л	600-1600	IgM г/л	0,7-1,5
СD8^+ (Т-киллеры) %%	10-40	IgА г/л	1-2,5
СD8^+ (Т-киллеры) кл/л	100-1200	IgЕ г/л	0-150 МЕ/мл
СD4^+/СD8^+ (ИРИ)	1,0-2,0	ЦИК усл.ед.	18-65
СD19^+ (В-лимфоциты) %%	10-20	Фагоцитарная активность %%	50-74
СD19^+ (В-лимфоциты) кл/л	100-600	Фагоцитарное число	5-9
CD16^+ (NК) %%	9-16	ХЛ фагоцитов спонтанная	1,0-1,8
CD16^+ (NК) кл/л	200-400	ХЛ стимулированная	3-12
ХЛ- хемилюминесценция нейтрофилов (спонтанная, стимулированная);

Таблица 12. Классификация иммунотропных препаратов

Группы иммуномодуляторов	Лекарственные препараты
Препараты микробного происхождения
Микробные липополисахариды	Пирогенал, продигиозан
Дрожжевые гидролизаты	Натрия нуклеинат
Бактериальные лизаты	ИРС-19, бронхо-мунал, имудон
Комбинированные иммунокорректоры, содержащие антигены бактерий и неспецифические иммуномодуляторы (липополисахариды, протеогликан)	Рибомунил (рибосомы бактерий), поликомпонентная вакцина ВП-4 (убитые бактерии), солкотриховак (убитые лактобациллы), солкоуровак (убитые бактерии)
Синтетические аналоги	Ликопид
Препараты тимического происхождения
Препараты тимуса	Тималин, Т-активин, тимоптин, тимактид, тимостимулин, вилозен
Синтетические аналоги факторов тимуса	Тимоген
Препараты костномозгового происхождения
Препараты костного мозга	В-активин, миелопид
Цитокины
Лимфокины	Ронколейкин, беталейкин
Интерфероны и их индукторы (иммуномодулирующие и противовирусные эффекты)	α-интерфероны: альфаферон, интерферон человека, локферон
	α -2а -интерфероны: роферон, реаферон
	α-2b-интерфероны: виферон, интрон А, реальдирон
	α -2c-интерфероны: Берофор
	α -2n-интерфероны: Вэлферон
	β-интерфероны: ребиф, ферон
	β-1b-интерфероны: бетаферон
	синтетические индукторы интерферонов: циклоферон, амиксин, ридостин, мегосин, полудан
Синтетические препараты разных групп
Иммуностимуляторы	Леакадин, левамизол, полиоксидоний, дибазол, диуцифон, метилурацил, пентоксил, галавит

Таблица 13. Иммунодепрессанты.

Группа	Препарат	Механизм действия	Применение
	Меркаптопурин	Подавление синтеза ДНК с ингибицией деления клеток	Лечение острого лейкоза, аутоиммунных болезней (коллагенозы и др.)
Антиметаболиты	Азатиоприн (имурель, имуран)	Нарушение синтеза нуклеиновых кислот и процессов распознавания антигена	Подавление реакций трансплантационного иммунитета, лечение аутоиммунных болзней (гемолитическая анемия, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и др.)
Метотрексат	Нарушение синтеза нуклеиновых кислот, подавление пролиферации, цитотоксический эффект	Лечение острого лейкоза, аутоиммунных болезней (коллагенозы и др.)
Фторурацил	Нарушение синтеза нуклеиновых кислот	Лечение злокачественных опухолей
Алкилирующие препараты	Циклофосфамид (циклофосфан, эндоксан)	Нарушение процессов репликации и транскрипции	Лечение острых лейкозов, злокачественных лимфом, рака молочной железы, матки и других злокачественных опухолей
Хлорбутин (хлорамбуцил, амбохлорин, лейкеран)	Нарушение процессов репликации и транскрипции	Подавление реакций трансплантационного иммунитета, лечение аутоиммунных болезней, хронического лимфолейкоза, рака яичников и других злокачественных опухолей
Проспидин	Противоопухолевая активность	Лечение злокачественных опухолей, ревматоидного артрита
Антибиотики	Актиномицин D	Торможение деления клеток и ДНК-зависимого синтеза РНК	Подавление реакций трансплантационного иммунитета
Митомицин С	Нарушение процессов репликации и транскрипции	Лечение рака мочевого пузыря и желудка
Циклоспорин (Циклоспорин А, сандиммун)	Подавление клеточных иммунных реакций и Т-зависимого образования антител	Подавление реакций трансплантационного иммунитета
	Антилимфоцитарные сыворотки	Элиминация Т-лимфоцитов и инактивация Т-клеточных рецепторов	Подавление реакций трансплантационного иммунитета, лечение гемолитической анемии

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Иммуноферментный анализ (ИФА - демонстрация). Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) адсорбированы на дне лунок по­листироловой пластины. В лунки внесены исследуемые образцы сывороток крови. Контроли: 1 - эталонная сыворотка с антителами против ВИЧ (положительный контроль), 2 - сыворотка, не содержащая антител ВИЧ (отрицательный контроль). Реакция проходит при 37⁰ С в течение I часа. После отмывки во все лун­ки вносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом (пероксидаза хрена), выдерживают 1 час при 37⁰, после чего вновь отмывают. Во все лунки вносят перекись водорода, которая расщепляется пероксидазой и индикатор (ортофенилендиамин), изменяющий свой цвет в результате химической реакции. Учет ре­акции производят на специальном (вертикальном) спектрофотометре. Положительный контроль характеризуется окра­шиванием среды в лунке в красно-коричневый цвет, так как в эталонной сыворотке содержались антитела к ВИЧ, вступившие в реакцию с антигенами, адсорбированными на дне лунки пластины. При добавлении меченой пероксидазой сыворотки против иммуногло­булинов человека антитела меченой сыворотки соединяются с антителами эталонной сыворотки и после второй отмывки также остаются в лунке. Поэтому в лунке контроля 1 произошла выраженная химическая реакция. Контроль 2 - бес­цветный, так как в сыворотке, внесенной в эту лунку, не со­держались антитела к ВИЧ- вирусу, поэтому в этой лунке не произошло цветной реакции с сывороткой против иммуноглобулинов человека, меченой пероксидазой. Интенсивность окраски в опытной лунке зависит от уровня антител к ВИЧ в исследуемой сыворотке,

2. Радиоиммунный анализ (РИА - демонстрация). Сущность РИА сходна с ИФА, однако сыворотку про­тив иммуноглобулинов человека метят не ферментом, а радиоактивным изотопом (Н³- тритием, С¹⁴, I¹²⁵, и т.д.).Результаты реакции учитывают с помощью д. и д. анализаторов. Студенты знакомятся с оборудованием для РИА.

3. Иммунофлюоресцентный метод (ИФМ - демонстрация). Антитела против антигенов вирусов и бактерий за счет ковалентных связей метят флюоресцирующим веществом (чаще всего изотиоцианатом флюоресцеина). Готовят микропрепараты на предметных стеклах из материала от больного (смыв из носоглотки, отделяемое бубона, мазки-отпечатки из трупного материала и т.д.) и обрабатывают их флюоресцирующей сывороткой. Если в микропрепаратах имеются антигены соответствующие антителам флюоресцирующей сыворотки, то антитела соединяются с ними и при люми­несцентной микроскопии образовавшиеся комплексы будут светиться. Эта модификация ИФМ называется прямой. При непря­мом ИФМ микропрепарат обрабатывают сначала обычной сывороткой против определенного антигена, а затем - антиглобулиновой флюоресцирующей сывороткой. Метод иммунофлюоресценции широко применяется для диагностики различных инфекций, в частности, гриппа и острых респираторных вирусных заболеваний. Студенты микроскопируют и зарисовывают клетки цилиндрического эпи­телия носоглотки человека, пораженные вирусом гриппа (прямой метод иммунофлюоресценции).