Тема 14. Учение об иммунитете. Серологические реакции. Антигены и их характеристика.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Антитела. Определение. Физико-химические, биологические свойства и функции. Авидность и аффинность антител.

2. Иммуноглобулины: классификация, основные классы, структура, свойства.

3. Антигенное строение иммуноглобулинов: изотипические, аллотипические, идиотипические детерминанты. Антиидиотипические антитела.

4. Полные и неполные антитела, их свойства и методы определения.

5. Биосинтез антител. Фазы синтеза антител. Динамика антителообразования и ее особенности при первичном и вторичном иммунном ответе. Иммунологическая память.

6. Реакция преципитации, сущность и варианты (кольцепрепипитация, иммунодиффузия в геле, иммуноэлектрофорез).

7. Реакции иммунного лизиса: бактериолиз, гемолиз, Реакция связывания комплемента, сущность и практическое применение.

8. Реакция нейтрализации токсина антителами в организме животных и ее практическое применение.

9. Реакция Кумбса, ее сущность и практическое применение.

ИНФОРМАЦИЯ К ЗАНЯТИЮ

Реакции иммунитета и их практическое применение для диагностики инфекционных заболеваний.

Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным реакциям, т.к. в ней участвует комплемент и две специфические системы антиген-антитело. Первая система стоит из антигена и антитела, вторая (индикаторная) – из эритроцитов барана и соответствующей им гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, реагируя с эритроцитами, делает их чувствительными (сенсибилизирует) к действию комплемента, в присутствии которого эритроциты разрушаются (лизируются).

РСК протекает в две фазы. В первой (специфической) взаимодействуют антиген, антитело и комплемент. Если антиген соответствует антителу, они соединяются и образуют комплекс, который связывает комплемент. Образовавшийся комплекс визуально не определяется и выявляется индикаторной гемолитической системой, участвующей во второй (индикаторной) фазе реакции. Если после добавления индикаторной системы гемолиза эритроцитов не наступает, комплемент связан первой системой и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу. Поэтому отсутствие гемолиза оценивается как положительный результат РСК (рис. 38, см. приложение). Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным, вызывая гемолиз эритроцитов. Таким образом, наличие гемолиза свидетельствует об отрицательном результате РСК.

РСК, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, нашла широкое применение в серодиагностике ряда инфекционных болезней и идентификации антигенов. Реакция применяется при диагностике сифилиса, других спирохетозов, риккетсиозов, вирусных и других инфекций.

Реакция нейтрализации используется при определении активности микробных (или другого происхождения) экзотоксинов. Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие токсина. Существуют 2 варианта постановки реакции: in vivo и in vitro.

Первый вариант заключается в том, что готовят последовательные разведения антитокси­ческой сыворотки, затем к каждому разведению добавляют определенную дозу токсина, смесь выдерживают 2 часа при температуре 37⁰ С, после чего вводят чувствительным животным. При нейтрализации токсина антитоксином животные не погибают.

Второй вариант реакции основан на феномене нейтрализации действия микробного токсина (например, гемолитического - 0-стрептолизина патогенного стрептококка) антитоксическими антителами иммунной сыворотки в пробирке. Отсутствие гемолиза свидетельствует о наличии антитоксических антител.

Другим вариантом реакции нейтрализации in vitro является флоккуляция, при которой при взаимодействии токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (инициальная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекционных болезней (сибирской язвы, менингококковой и пневмококковой инфекций, дизентерии). В судебно-медицинской практике ее используют для определения видовой принадлежности крови и т. д.; при проведении санитарно-гигиенических исследований для установления фальсификации продуктов. Эта реакция служит также для определения филогенетического родства животных, растений и микроорганизмов. В качестве антигена используют полноценные белковые, а также гаптены (полисахаридные, липо-полисахаридные, гликопротеидные) антигены микроорганизмов или высших организмов. Иммунную преципитирующую сыворотку, содержащую антитела, применяют неразведенной или в небольшом разведении (1:5-1:10). Основными методами реакции являются кольцепреципитация и реакция преципитации в геле.

Реакцию кольцепреципитации ставят в специальных преципитационных пробирках (диаметр 0,4-0,5 см, высота 7—8 см). В пробирку вносят 0,2 мл иммунной сыворотки, на которую осторожно наслаивают такой же объем антигена. Параллельно в том же объеме ставят контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками, контроль антигена (антиген в изотоническом растворе хлорида натрия), контроль сыворотки (исследуемая сыворотка в изотоническом растворе хлорида натрия). Реакцию учитывают после 5-30 минутной инкубации в термостате при 37⁰С. Положительный результат характеризуется появлением белого кольца (преципитата) на границе антигена и антитела.

Реакция преципитации в геле (агаровом, крахмальном, полиакриламидном) позволяет четко разграничить преципитаты, образованные различными системами антиген-антитело, в разных участках геля. Метод широко используется для определения токсигенности дифтерийных бактерий, определения иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови человека и т.д.

Иммуноэлектрофорез основан на принципе сочетания электрофореза и реакции преципитации в геле. С помощью этого метода анализируют различные антигены микробов и вирусов, антитела, сыворотку крови человека, ликвор и т.д. Исследуемый материал вносят в лунку, расположенную в геле на стеклянной пластине и разделяют его фракции электрофорезом. Затем в траншею, вырезанную в геле параллельно линии электрофоретической миграции белков, вносят сыворотки против антигенов, которые хотят обнаружить (например, против антигенов менингококка). Антитела сыворотки диффундируют в агар и в местах встречи с соответствующими антигенами образуют зоны преципитации в виде дуги.

Определение неполных антител (реакция Кумбса). Эта реакция позволяет выявить неполные (одновалентные) антитела, которые при соединении с эритроцитами, бактериями и риккетсиями не дают видимых эффектов реакции антиген-антитело, появляясь в крови больных в более ранние сроки и в более высоких титрах, чем полные. Прибавление кроличьей сыворотки против глобулинов человека приводит к агглютинации, т.к. антитела этой сыворотки бивалентны и взаимодействуют с неполными антителами, связанными с поверхностными антигенами бактерий или эритроцитов, с образованием видимого осадка в виде зонтика.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК). Реакцию ставят в соответствии с таблицей 11. РСК протекает в две фазы. В первой фазе реакции участвуют антиген, антитело, комплемент. При соот­ветствии антигена антителу образуется комплекс, связывающий комплемент. При отсутствии соответствия антигена и анти­тела комплемент остается свободным. Вторая фаза реакции (ин­дикаторная) выявляет связывание комплемента и происходит меж­ду комплементом и реагентами гемолитической системы (смесь взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки). Если комп­лемент связан в первой фазе реакции, гемолиза эритроцитов под действием гемолизинов не происходит (задержка гемолиза - реакция положитель­на); если комплемент свободен, наблюдается гемолиз (реакция отрицательна).

2. Постановка и учет реакции кольцепреципитации по Асколи. Реакция Асколи используется для выявления термостабильного анти­гена возбудителя сибирской язвы в материале (кожа, шерсть), подозрительном на загрязнение данными микробами. Техника постановки реакции: в преципитационную пробирку наливают цельную преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в количестве 0,5 мл. Пастеровской пипеткой наслаивают по стенке пробирки 0,5 мл исследуемого антигена. Антиген готовят путем кипячения ма­териала в растворе кислоты. В контрольную пробирку добавляют вместо антигена физиологический раствор. В случае положительного результата на границе антигена и сыворотки обра­зуется преципитат в виде кольца.

3. Учет реакции преципитации в геле для определения токсигенности дифтерийных бактерий (демонстрация). Чашку Петри заливают питательным агаром, на дно чашки накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной противодифтерийной анти­токсической сывороткой. Перпендикулярно полоске бумаги засевают исследуемую Таблица 11

Схема постановки реакции связывания комплемента

 

Компоненты реакции	Опыт	КПС	КОС	КС	КА	КК	КГС
Сыворотка больного 1:5, мл	0,5	-	-	0,5	-	-	-
Антиген в рабочем титре, мл	0,5	0,5	0,5	-	0,5	0,5	-
Комплемент в рабочей дозе, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Положительная сыворотка, мл	-	0,5	-	-	-	-	-
Отрицательная сыворотка, мл	-	-	0,5	-	-	-	-
Физиологический раствор	-	-	-	0,5	0,5	0,5	1,0
Инкубация при 37^0С в течение 30 минут
Гемолитическая система	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Инкубация при при 37^0С в течение 30 минут, учет результатов

 

Обозначения: КПС – контроль положительной сыворотки, КОС – контроль отрицательной сыворотки, КА- контроль антигена, КК – контроль комплемента, КГС – контроль гемолитической системы

 

Рис. 15. Реакция преципитации в геледля определения токсигенности дифтерийных бактерий

культуру. Посев инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Выделяющийся при росте дифтерийной палочки токсин диффундирует в питательную среду и вступает в реакцию с антитоксическими антителами. В местах взаимодействия дифтерийного токсина с антителами формируется преципитат в виде беловатых линий

4. Иммуноэлектрофорез (демонстрация). С помощью иммуноэлектрофореза анализируют различные антигены микробов и вирусов, антитела, сыворотку крови человека, ликвор и т.д. Исследуемый материал вносят в лунку, расположенную в геле на стеклянной пластине и разделяют его фракции электро­форезом. Затем в лунку, вырезанную в геле параллельно линии электрофоретической миграции белков, вносят сыворотки против антигенов, которые хотят обнаружить (например, против антигенов менинго­кокка). Антитела сыворотки диффундируют в агар и в местах встречи с со­ответствующими антигенами образуют зоны преципитации в виде дуги.

5. Реакция нейтрализации токсина антитоксином при ботулизме (демонстрация). Реакцию ставят с фильтратом, полученным из консервов домашнего приготовления (например, из грибов), послуживших причиной отрав­ления больного. К фильтрату добавляют поливалентную противоботулиническую сыворотку в раз­ведении 1:40. Смесь выдерживают 2 часа при температуре 37⁰ С, вводят мыши внутрибрюшинно в объеме 0, 5 мл. Контроль­ной мыши вводят 0,5 мл фильтрата. Если токсин, содержащийся в фильтрате, соответствует сыворотке, то произой­дет нейтрализация токсина и мышь не погибнет. Контрольная мышь погибает с явлениями параличей.

6. Учет реакции Кумбса (демонстрация). Реакция Кумбса позволяет выявить неполные (одновалентные) антитела, которые при соединении с эритроцитами, бактериями и риккетсиями не дают видимых эффек­тов реакции антиген-антитело. Прибавление кроличьей сыворот­ки против глобулинов человека приводит к агглютинации, т.к. антитела этой сыворотки бивалентны и взаимодействуют с непол­ными антителами, связанными с бактериями или эритроцитами, с образованием осадка.

Реакция Кумбса при бруцеллезе ставится в тех случаях, ког­да титр классического варианта реакции агглютинации меньше диагностического (1:100). Добавление в пробирки с отрицательными результатами антиглобулиновой сыворотки приводит к увеличению титра антител. Это связано с тем, что неполные антитела появляются в крови больных в более ранние сроки и в более высоких титрах, чем полные.

7. Реакция флоккуляции (демонстрация). В результате взаимодействия ток­сина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (иници­альная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Реакцию ставят в два этапа. Сначала по стандартной сыво­ротке устанавливают пороговую величину флоккуляции Lf(Limes flocculationis) в 1 мл токсина. Lf токсина определяется его минимальным количеством, которое дает инициальную флоккуляцию с 1 международной единицей (ME) сыворотки. Затем известной силы токсин и испытуемую антитоксическую сыворотку разливают в пробирки в опреде­ленном объеме, выдер­живают в водяной бане при температуре 45 °С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в одной из них.

Инициальная флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки. Если флоккуляция произошла в 3-й пробирке, в 0,4 мл сыворотки находится 40 ME. Сле­довательно, 1 мл сыворотки содержит 40:0,4=100 ME.

8. Антистрептолизиновая реакция (демонстрация). Реакция основана на фе­номене нейтрализации гемолитического действия микроб­ного токсина (0-стрептолизина) антитоксическими антитела­ми иммунной сыворотки.

Для постановки реакции предварительно определяют мини­мальную гемолитическую дозу токсина (0-стрептолизина), т.е. наименьшее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5% взвеси эритроцитов кролика. Затем определяют рабочую дозу 0-стрептолизина, т.е. наибольшее количество токсина, которое в смеси с 1 АЕ (антитоксической единицы) стандарт­ной антитоксической сыворотки полностью нейтрализуется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Для постановки основного опыта готовят разведения исследуемой сыворотки, к каждому из которых добавляют рабочую дозу токсина, инкубируют 45 мин при 37⁰ С, затем вносят равный объем взвеси эритроцитов и инкубируют 1 час при 37⁰ С и 18 часов при комнатной температуре. Обязательным является контроль на возможность спонтанного гемолиза эритроцитов. Положительная реакция характеризуется отсутствием гемолиза в результате нейтрализации стрептолизина (гемолизина) соответствующими антителами. Студенты производят учет демонстрационной реакции.

9. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА - демонстрация) основана на взаимодействии вирусных антигенов (гемагглютининов) со специфическими антителами, в результате чего происходит блокада (торможение) гемагглютинирующей активности вируса.

Развернутую РТГА ставят в лунках полистироловых плас­тин. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглютинации для подбора рабочей дозы. В лунках готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки, добавляют равный объем взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 2 ч при температуре 37⁰ С. Затем добавляют 1 % взвеси куриных эритроцитов, инкубируют 2 ч и оценивают результат по феномену торможения гемагглютинации. Положительная РТГА характеризуется образованием плотного осадка эритро­цитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА. Произвести учет демонстрационной РТГА.

Педиатрические аспекты темы

1. Возрастные особенности иммунологической реактивности. Динамика антителообразования в развивающемся организме.

2. Иммунологические взаимоотношения в системе мать – плод. Изо­антигены эритроцитов АВО. Резус-антиген и его значение в патологии беременности.