Понятие об иммунитете. Антигены и антитела Серологический метод исследования в микробиологии

Иммунитет (immunitas – освобождение от чего-либо) – совокупность реакций организма, направленных на сохранение его целостности при воздействии на него генетически чужеродных структур, в том числе микроорганизмов. Функции иммунитета выполняет иммунная система, состоящая из лимфоидной ткани.

Сопротивляемость организма к инфекции зависит не только от специфического ответа на определенный генетически чужеродный агент, но и от ряда неспецифических факторов - непроницаемости кожных и слизистых покровов для микроорганизмов, кислотности желудочного сока, присутствия в крови и других жидкостях организма (слюна, слезы и др.) бактерицидных систем (комплемент, пропердин, лизоцим). Важным фактором неспецифической защиты организма является фагоцитоз – процесс поглощения и переваривания генетически чужеродных веществ клетками- фагоцитами из системы макрофагов.

Специфический иммунный ответ в виде образования антител или специфических иммунных клеток развивается при действии антигенов.

Антигены — генетически чужеродные вещества, которые при введении в организм вызывают развитие специфических иммунологических реакций. Антигенами могут быть микробные токсины, другие яды, ферменты, полисахариды и комплексные вещества (липополисахариды, липопротеины, гликолипиды) и т. д. Антиген должен быть чужеродным для данного организма. Существуют неполноценные антигены (гаптены), которые не вызывают образование антител, но реагируют с ними. Основными свойствами антигена, помимо чужеродности, является достаточно большой размер молекулы и сложная структура.

Антигенная структура микробной клетки. У подвижных бактерий обнаружен жгутиковый термолабильный белковый Н-антиген (флагеллин). О-антиген является липопротеидным термостабильным антигеном клеточной оболочки, К-антиген (в том числе Vi- антиген вирулентных видов энтеробактерий) - капсульным полисахаридом. Токсины и ферменты бактерий, как и другие белки, являются полноценными антигенами. Антигены бактерий используют для создания вакцинных препаратов и серологической диагностики инфекционных болезней. На основании различий в химической структуре антигенов ряд микробных видов подразделяется на серовары.

Антитела — специфические белки крови, образующиеся в клетках лимфоидной ткани организма при введении антигенов и обладающие способностью вступать с ними в специфические реакции. Антигены, связанные с антителами (иммунные комплексы), обезвреживаются иммунными системами макроорганизма и удаляются из него.

Реакции иммунитета (серологические реакции). В связи с высокой специфичностью и чувствительностью реакции взаимодействия анти­гена и соответствующего ему антитела эти реакции широко применяются для лабораторной диагностики инфекционных болезней.

Серологические реакции применяют в двух направлениях: 1) для выявления антител в сыворотке больного с помощью известного антигена (серологический метод диагностики инфекционного заболевания; 2) для определения вида или серовара микроорганизма при его идентификации с помощью известного антитела.

В зависимости от состояния антигена и особенностей среды, в которой взаимодействуют антигены и антитела, различают реакцию агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, нейтрализации и др.

Реакции агглютинации (РА) - склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток под действием антител в присутствии солей (обычно используется изотонический раствор хлорида натрия). Определяемые антитела (агглютинины) находятся либо в сыворотке крови больного человека либо иммунного животного; антигеном является взвесь убитых или живых микроорганизмов.

Для получения сыворотки кровь у человека берут обычно из вены, собирают в стерильную пробирку, оставляют на час при комнатной температуре или при 37⁰ С на 30 мин. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки стеклянной палочкой, пробирку оставляют в холодильнике на ночь для лучшего отделения сыворотки. На следующий день сыворотку отсасывают, при необходимости освобождают от форменных элементов крови центрифугированием.

Иммунные диагностические сыворотки, содержащие антитела к определенному антигену, получают чаще из крови кроликов или лошадей, многократно иммунизированных соответствующим антигеном (взвесь живых или убитых микроорганизмов, анатоксины, экстракты клеток и тканей, эритроциты и т. п.).

Для определения антител в крови больного человека можно использовать живые культуры микроорганизмов, однако чаще используются взвеси убитых микроорганизмов (диагностикумы). Реакция агглютинации ставится в 2 вариантах: ориентировочная реакции на стекле и развернутая реакция в пробирках.

Для постановки ориентировочной реакции агглютинации на предметное стекло наносят по 2 капли известной сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора вносят петлей культуру исследуемого микроорганизма, тщательно перемешивают и через 1-3 минуты учитывают реакцию. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контрольной. Реакция считается положительной в том случае, когда в капле, где культура смешана с сывороткой, выпадают хлопья агглютината, контроль сыворотки остается прозрачным, а в контроле антигена отмечается равномерное помутнение (рис.35, см. приложение).

Постановка развернутой реакции агглютинации предполагает приготовление разведений (обычно двукратных в объеме 1,0 мл) известной диагностической или исследуемой от больного человека сыворотки, в которые добавляют 0,1 мл (2 капли) живых или убитых микроорганизмов. В качестве двух контролей используют сыворотку в максимальной концентрации (антиген в нее не вносят), а также изотонический раствор хлорида натрия, в который вносят антиген. Положительная реакция характеризуется выпадением на дно пробирок хлопьевидного или зернистого осадка в виде зонтика, жидкость над осадком при этом просветляется. При встряхивании осадка (агглютината) видны хлопья, плавающие в прозрачной жидкости. В контроле антигена наблюдается осадок в виде пуговки (при встряхивании - равномерное помутнение), в контроле сыворотки – полная прозрачность.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) - агглютинация эритроцитов, нагруженных антигеном или антителом, под влиянием специфических антител или антигенов с целью определения неизвестных антител или антигенов (рис. 36, см. приложение). Реакцию ставят в специальных полистироловых планшетах (обычно в двукратных разведениях сыворотки или материала, содержащего антиген, объемом 0,2 мл), добавляют соответствующий антигенный или антительный эритроцитарный диагностикум, выдерживают в термостате при 37⁰ С или при комнатной температуре 2 часа, учет производят сразу после этого или на следующий день.

Контролем служит взвесь эритроцитов с заведомо иммунной и нормальной сыворотками. В первом случае должна произойти агглютинация, во втором ее не должно быть. Контролем антигена служит взвесь нормальных эритроцитов, к которым добавлена испытуемая сыворотка, а также раствор хлорида натрия, к которому добавляют эритроцитарный диагностикум (в обоих контролях не должно быть агглютинации).

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Продолжение работы по идентификации культуры, выделенной из органов зараженного животного в результате биопробы:

· отбор колонии на плас­тинчатом МПА для последующего исследования;

· характеристика свойств коло­нии по следующим критериям: величина, цвет, форма, характер края и поверхности, структура;

· изготовление микропрепарата, окраска его по Граму, микроскопия;

· учет биохимической активности выделенного возбудителя,

· постановка ориентировочной реакции агглютинации на стекле с агглютинирующимисыворотками S.enteritidis, S.choleraesuis, S. typhimurium: по 1 капле соответствующих сывороток в разведении 1:10 наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло; капля физиологического раствора используется для контроля. В каждую каплю вносят петлей небольшое количество культуры и эмульгируют ее. Через несколько минут в одной из капель образуются хлопья – агглютинация. Контрольная капля и капли с сыворотками, где результат отрицательный, остаются мутными. На основании результатов опыта сделать заключение о виде выделенного возбудителя.

2. Постановка и учет развернутой реакции агглютинации с сывороткой крови больного при подозрении на бруцеллез (14 день заболевания).

Сыворотка больного титруется, т.е. последовательно разводится в физиологическом растворе. Разведение в пробирке № 1 - 1:50, в пробирках №№ 2, 3, 4, 5 разведения соответственно 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. Их получают, смешивая равные объемы (по 0,5 мл) физиологического раствора и разведенной сыворотки из предыдущей пробирки. Во все пробирки вносят равные количества бруцеллезного диагностикума (взвесь убитых бактерий) - по 2 капли. Пробирки инкубируют в термостате при 37⁰ С в течение 2 часов, 18-20 часов при комнатной температуре. В контрольных пробирках находятся только физиологический раствор и диагностикум или сыворотка - в них результат будет отрицательным: частицы диагностикума опустятся на дно пробирки в виде маленького белого диска. В положительном случае на дне пробирки выпа­дает осадок хлопьев в виде «зонтика». Титр антител определяют по наибольшему разведению сыворотки, при котором наблюдается образование агглютината. Диагностический титр антител при бруцеллезе - 1:100. Реакцию ставят по следующей схеме (табл. 9):

Таблица 9. Постановка развернутой реакции агглютинации

 

Компоненты реакции	Разведения сыворотки	КД	КПС
1:25	1:50	1:100	1:200
Физиологический раствор в мл	-	1,0	1,0	1,0	1,0	-
Исследуемая сыворотка в мл	1,0	1,0	1,0	1,0	-	1,0
Диагностикум, капли

КД – контроль диагностикума, КПС – контроль положительной сыворотки

 

В развернутой реакции агглютинации студентам необходимо определить титр (количество) антител в сыворотке по наибольшему разведению, где наблюдается положительный результат.

3. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов (завершенный фагоцитоз стафилококка). Фагоцитоз - это поглощение лейкоцитами и макрофагами микробов, чужеродных частиц, "обломков" погибших клеток, иммунных комплексов (конгломерат антитело + антиген). Фагоцитоз может заканчиваться перевариванием микробов - завершенный фагоцитоз. В пробирку помещают 0,1 мл 2% раствора лимоннокислого натрия, 0,2 мл исследуемой крови, 0,1 мл взвеси тест - культуры стафилококка (концентрация 400 млн. микробных тел в 1 мл), содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Затем пробирки центрифугируют и из сероватой пленки на границе плазмы и эритроцитов готовят мазки, которые фиксируют в смеси Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. Микроскопируют с использованием иммерсионной системы. Определяют фагоцитарную активность лейкоцитов (ФА - процент фагоцитирующих клеток при подсчете 100 фагоцитов) и фагоцитарный показатель (ФП - число микробов, погло­щенных одним лейкоцитом). У здоровых лиц ФП составля­ет 5-9, ФА - 50 – 70%.

4. Изучение незавершенного фагоцитоз гонококка (микроскопия демонстрационного микропрепарата, приготовленного из гнойного отделяемого уретры больного гонореей – рис. 37, см. приложение). Незавершенный фагоцитоз – это состояние, когда лейкоциты не в состоянии уничтожить и переварить захваченные микроорганизмы.

5. Учет реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с сывороткой крови больного при подозрении на носительство брюшнотифозного микроба - демонстрация. РНГА используется для выявления антител в крови больного или для идентификации неизвестного возбудителя по антигенам в патологическом материале. Соответственно используют коммерческие эритроцитарные диагностикумы из эритроцитов, нагруженных антигенами или антителами. В данном случае используется антигенный Vi – эритроцитарный брюшнотифозный диагностикум. Постановка реакции: в лунках пластмассовых пластин готовят разведения сыворотки больного от 1:25 до 1:200 в объеме 0,5 мл, в каждую лунку вносят по 2 капли эритроцитарного диагностикума, инкубируют при 37⁰С в течение 2 часов. Положительная реакция характеризуется образованием на дне лунки осадка с неровным краем в виде «зонтика» или «розетки», при отрицательном результате выпадает осадок в виде «пуговки» Диагностический титр 1:100. Контроли – КПС (контроль положительной сыворотки - эритроцитарный диагностикум + сыворотка, содержащая антитела к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа + физиологический раствор); КД – (контроль диагностикума - эритроцитарный диагностикум + физиологический раствор, гемагглютинации не наблюдается).

Рис. 13. Завершенный фагоцитоз стафилококка

Ход реакции: в лунках пластмассовых пластин готовят разведения сыворотки больного от 1:25 до 1:200 в объеме 0,5 мл, в каждую лунку вносят по 2 капли эритроцитарного диагностикума, инкубируют при 37⁰С в течение 2 часов. Положительная реакция характеризуется образованием на дне лунки осадка с неровным краем в виде «зонтика» или «розетки», при отрицательном результате выпадает осадок в виде «пуговки» Диагностический титр 1:100. Контроли – КПС (контроль положительной сыворотки - эритроцитарный диагностикум + сыворотка, содержащая антитела к Vi-антигену возбудителя брюшного тифа + физиологический раствор); КД – (контроль диагностикума - эритроцитар­ный диагностикум + физиологический раствор, гемагглютинации не наблюдается).

 

Рис. 14. Незавершенный фагоцитоз гонококка

 

Педиатрические аспекты темы

1. Обратить внимание на особенности фагоцитарной реакции, незавершенность фагоцитоза у новорожденных детей.

2. Изучение неспецифических факторов резистентности организма проводится в сравнительном аспекте – в детском и взрослом организме, отмечается большое значение неспецифических факторов защиты в детском организме.

3. Развитие клеточных неспецифических механизмов защиты. Особенности воспалительной реакции у детей раннего возраста. Незавершенность фагоцитоза.