Микроскопические методы исследования

Микроскопические методы исследования — способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине этими методами изучают строение микроско­пических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза че­ловека. Основу микроскопических методов ис­следования составляют СМ и ЭМ. СМ имеет несколько разновидностей, каждая из которых использует различные свойства света: фазово-контрастная, интерференционная, люми­несцентная, поляризационная, стереоскопи­ческая, ультрафиолетовая, инфракрасная. В ЭМ изображение объектов исследования возникает в результате направленного потока электронов.

Световая микроскопия

СМ основывается на таких определяющих факторах, как разрешающая способность мик­роскопа, направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, кото­рый может быть прозрачным и непрозрачным. В зависимости от свойств объекта изменяют­ся физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой вол­ны, фаза, плоскость и направление распрост­ранения волны. Для СМ биологические объек­ты обычно окрашивают для выявления тех или иных их свойств. При этом ткани должны быть фиксированы, так как окраска выявляет опре­делённые структуры только погибших клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает клеточные структуры. Тем не менее в СМ мож­но изучать и живые биологические объекты (витальная микроскопия). В этом случае при­меняют тёмнопольный конденсор.

Фазово-контрастная микроскопия применяется для исследования живых и неокрашенных био­логических объектов. Она основана на диф­ракции луча света в зависимости от особенно­стей объекта изучения, от которых зависит изменение длины и фазы световой волны. В патологии фазово-контрастная микроскопия находит применение при исследовании про­стейших, клеток растений и животных, при подсчёте и дифференцировке клеток костного мозга и периферической крови, при изучении клеток культуры тканей и др.

Поляризационная микроскопия позволяет изучать биологические объекты в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т.е. в поляри­зованном свете. Этого достигают с помощью плёнчатых поляроидов или призм Николя, ко­торые помещают в микроскопе между источ­ником света и препаратом. Поляризация меня­ется при прохождении (или отражении) лучей света через различные и оптически разнород­ные структуры. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляри­зованного света не зависит от плоскости поля­ризации, а в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или попереч­ной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двой­ное лучепреломление, при обратных взаимоот­ношениях — отрицательное двойное лучепре­ломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, яв­ляются анизотропными и обладают положитель­ным двойным лучепреломлением. Такими свой­ствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера лучепреломления поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной орга­низации его структуры. Поляризационная мик­роскопия является одним из гистологических, а также цитологических методов исследова­ния, способом микробиологической диагнос­тики и др. Важно, что в поляризованном све­те можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные (нативные) срезы тканей.

Люминесцентная микроскопия основана на свойстве многих веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фи­олетовой части спектра света. Ряд биологичес­ких веществ, таких как простые белки, коферменты, некоторые витамины, лекарственные средства (ЛС) обладают собственной (первич­ной) люминесценцией. Другие вещества начи­нают светиться при добавлении к ним специаль­ных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распре­деляться в клетке диффузно, но могут избира­тельно окрашивать отдельные клеточные струк­туры или определённые химические соединения. На этом основано использование люминесцен­тной микроскопии в цитологических и гисто­химических исследованиях. Иммунофлюоресценция в люминесцентном микроскопе позволяет выявлять различные Аг и их концентрацию в клетках, при этом возможна идентификация вирусов, определение AT и иммунных комплек­сов, гормонов, различных продуктов метаболиз­ма и др.Люминесцентную микроскопию применяют для диагностики вирусных инфекций, с помо­щью вторичной люминесценции диагностиру­ют злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют оча­ги ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т. д.

Ультрафиолетовая и инфракрасная микроско­пия основана на способности поглощения УФ- и инфракрасных лучей определённых длин волн некоторыми веществами, входящими в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных тканей, прозрачных в видимом свете. Свойством по­глощать УФ-лучи обладают высокомолекуляр­ные соединения, такие как нуклеиновые кис­лоты, белки, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, метилаланин), пуриновые и пиримидиновые основания и др. С по­мощью УФ-микроскопии изучают локализа­цию и количество таких веществ, а при исследовании живых объектов — их измене­ния в процессе жизнедеятельности. Инфра­красная микроскопия применяется в медицине преимущественно в нейроморфологии и офтальмологии.

Для специальных целей в патологии исполь­зуются и другие микроскопические методы — интерференционная, стерео­скопическая микроскопия и др.

Электронная микроскопия

ЭМ применяют для изучения структуры клеток, микроорганизмов и вирусов на субклеточном и макромолекулярном уровнях. Значительную раз­решающую способность ЭМ обеспечивает по­ток электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электро­магнитными линзами. При трансмиссионной ЭМ электроны проходят через структуры ис­следуемого объекта, а при сканирующей ЭМ они отражаются от этих структур, отклоняясь под разными углами. В результате возникает изображение на люминесцирующем экране микроскопа. При трансмиссионной (просве­чивающей) ЭМ получают плоскостное изобра­жение внутриклеточных структур, при скани­рующей — объёмное. Весьма полезно сочетание ЭМ с другими методами — авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими мето­дами. Возникает возможность наблюдать тече­ние биохимических и иммунологических про­цессов в клетке в сочетании с изменениями внутриклеточных структур. ЭМ требует специальной химической или фи­зической фиксации тканей. Для исследования берут в основном биопсийный материал. Мо­жет быть использован и секционный матери­ал, но в максимально короткие сроки после смерти, обычно исчисляемые минутами. Пос­ле фиксации ткани обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на ультратомах. При этом получают ультратонкие срезы тканей толщи­ной 30—50 нм. Их контрастируют, переносят на специальные металлические сетки и затем изучают в ЭМ.

При ультратомировании препарата можно полу­чить так называемые полутонкие срезы толщи­ной 1,5 мкм, которые после окраски метиленовым синим исследуют в СМ. Это позволяет получить представление о состоянии той ткани, клетки которой будут затем изучены в ЭМ. Ме­тод может иметь и самостоятельное значение.

В сканирующем (растровом) ЭМ исследуют по­верхность биологических и небиологических объектов, напыляя в вакуумной камере на их поверхность электроноплотные вещества и изу­чая эти реплики, повторяющие контуры объек­та исследования.

Методы окрашивания

Микроскопические методы используют в ме­дицине в сочетании с гистологическими методами исследования клеток и тканей. Для это­го, как правило, фиксированные тканевые срезы должны быть окрашены с целью выявле­ния различных клеточных структур. Последние воспринимают красители в зависимости от их физико-химических свойств. Поэтому красители подразделяют на основные, кислые и ней­тральные.

Основные, или базофильные, красители являют­ся красящими основаниями или их солями (ге­матоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий и др.). В цветовой гамме этих красителей преобладают оттенки синего цве­та. Интенсивность окраски (базофилия) зави­сит от числа кислотных групп в структурах клетки, способных взаимодействовать с основными красителями. Кислые, или ацидо­фильные, красители — красящие кислоты или их соли, окрашивающие клеточные структу­ры в различные оттенки красного (эозин, эритрозин, Конго красный, оранж и др.). Ней­тральные, красители содержат и базофильные, и ацидофильные вещества (например, смесь Романовского—Гимзы). Такие красители мо­гут обладать способностью растворяться в оп­ределённых веществах, окрашивая их (судан III, шарлах и др.). Нередко для контрастиро­вания структур клеток или тканей использу­ют методы, основанные на способности этих тканей удерживать или восстанавливать соли тяжёлых металлов (серебра, золота, осмия, свинца и др.). Эти методы контрастирования называются импрегнацией, они используются как в СМ, так и в ЭМ.

С помощью различных красителей в повседнев­ной и научной практике применяют обзорные окраски для составления общего представле­ния о состоянии исследуемой ткани (гематок­силин и эозин, азур-фукселин и др.), а также специальные окраски для выявления особен­ностей процессов, протекающих в тканях и клетках. Так, используют окраску Суданом III для выявления жировой дистрофии клеток, Конго красным — для определения отложений амилоида, импрегнацию серебром — для ис­следования нервной ткани и т.п. Живые и нео­крашенные объекты исследуют с помощью специальных микроскопических методов, опи­санных выше.

Гистохимические методы

Гистохимические и гистоферментохимические методы позволяют проследить и оценить об­мен веществ в тканях и клетках в норме и вусловиях патологии; избирательно оценить метаболизм белков, липидов, углеводов и дру­гих метаболитов, локализацию и активность ферментов и гормонов, проанализировать осо­бенности окислительно-восстановительных процессов, протекающих в клетках и тканях в условиях патологии, при приспособлении и компенсации. Диапазон применения гистохи­мических методов в патологии необычайно широк. Для гистохимических исследований используют срезы свежезамороженных тканей, приготовленные в криостате, что позволяет сохранить прижизненную локализацию того или иного химического соединения. Гистохи­мические методы часто сочетают с другими методами СМ и ЭМ. Для количественной оцен­ки результатов гистохимических реакций при­меняют гистофотометрию, цитофотометрию, микрофлюорометрию и др.