Методы исследования функций фагоцитов.

С помощью лабораторных методов можно оценить следующие функции моноцитов и макрофагов: представление антигена Т-лимфоцитам, антителозависимую клеточную цитотоксичность, противоопухолевую цитотоксичность, хемотаксис, фагоцитоз и бактерицидную активность. Кроме того, можно исследовать продукцию цитокинов активированными макрофагами.

Исследуют такие функции нейтрофило в, как хемотаксис, адгезию, фагоцитоз, бактерицидную активность и продукцию свободных радикалов кислорода.

2.3.1. Методы определения хемотаксиса лейкоцитов. Направленное движение лейкоцитов в сторону стимулирующего агента – хемоаттраканта называется хемотаксисом. Хемотаксис нейтрофиловисследуют с помощью камеры Бойдена. Эта камера состоит из двух отделений, между которыми находится фильтр. В одно отделение камеры помещают суспензию нейтрофилов, в другое – хемотаксический фактор, например С5a. После инкубации нейтрофилов в камере Бойдена определяют, какое их количество мигрировало на противоположную сторону фильтра. Для исследования хемотаксиса нейтрофилов in vivo используется метод кожного окна. С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм² (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0,5—2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами.

Нарушения хемотаксиса наблюдают при ряде врожденных заболеваний фагоцитарной системы: синдромах Чедиака-Хигаси, дефектах адгезии лейкоцитов, при вторичных иммунодефицитных состояниях.

2.3.2. Определение адгезивных свойств. За адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов отвечают поверхностные рецепторы – селектины и интегрины. Обычно определяют экспрессию поверхностных антигенов CD11a, CD18, CD11b, CD11c с помощью моноклональных антител в методе проточной цитометрии. При иммунодефицитах, обусловленных нарушением адгезии лейкоцитов, наблюдается снижение экспрессии этих антигенов, как на покоящихся, так и на активированных клетках. Для определения функциональной активности адгезивных молекул фагоцитов используется оценка их способности прикрепляться к пластику, стеклу, культуре эпителиальных клеток.

Нарушение адгезивных свойств фагоцитирующих клеток наблюдают при врожденных синдромах, связанных с нарушением экспрессии молекул адгезии – ЛАД-синдром I-го и II-го типа. К лабораторным признакам этих иммунодефицитов относится также нейтрофильный лейкоцитоз. Иммунодефициты, обусловленные нарушением адгезии лейкоцитов, проявляются рецидивирующими инфекциями, медленным заживлением ран и отсутствием гнойного отделяемого в очагах инфекции.

2.3.3. Определение фагоцитарной способности. Традиционным методом оценки стадии поглощения является подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, захваченных нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный индекс), и количество частиц, захваченных одной клеткой (фагоцитарное число). В качестве объекта фагоцитоза используют различные бактерии, простейшие или синтетические частицы (латекс, зимозан). Оценка фагоцитоза с помощью проточной цитометрии является наиболее точным, быстрым и объективным методом.

Определение фагоцитоза имеет значение в комплексной диагностике при первичных (синдром Чедиака-Хигаси) и вторичных иммунодефицитах.

2.3.4. Оценка бактерицидной активности. Определение внутриклеточной гибели микробов показывает завершенность фагоцитарного процесса и является суммарным показателем функциональной активности фагоцитарных клеток. Бактерицидность фагоцитов обусловлена кислородозависимыми (образование активных форм кислорода в процессе кислородного взрыва) и кислородонезависимыми (ферменты гранул) механизмами. Для оценки киллинга используют простейший микроскопический метод идентификации дегенеративных, полуразрушенных микробов в окрашенных препаратах лейкоцитов. Надежным и простым методом оценки внутриклеточной гибели микробов является проточная цитометрия с использованием флюоресцентных красителей, дифференцированно окрашивающих живые и убитые микробные клетки.

С целью определения образования активных форм кислорода используют НСТ-тест и проточную цитометрию. НСТ-тест основан на восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анионом, образующимся при кислородном взрыве в лейкоцитах. Суть метода заключается в следующем: к фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. Реакцию учитывают микроскопически по количеству темно-синих гранул диформазана в клетке, образующихся при восстановлении НСТ.

Отсутствие восстановления нитросинего тетразолия — характерный признак хронической гранулематозной болезни. НСТ-тест позволяет идентифицировать синдром Чедиака-Хигаси, дефицит миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и другие первичные иммунодефициты фагоцитарного звена. Повышенная способность фагоцитов к образованию активных форм кислорода наблюдается при воспалительных процессах инфекционной природы в организме.

 

2.4. Методы оценки системы комплемента.

Комплемент — это группа сывороточных белков, состоящая из протеаз и их активаторов. Существуют два механизма активации комплемента — классический и альтернативный. Комплемент играет важную роль в защите от микробов, активирует катаболизм циркулирующих иммунных комплексов и участвует в регуляции функций иммунной системы.

Для исследования компонентов классического пути активации комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения сыворотки больного и нормальной сыворотки добавляют к эритроцитам барана, покрытым антителами; 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. За единицу гемолитической активности комплемента принимают величину, обратную тому разведению сыворотки, при котором разрушаются 50% эритроцитов. Определение гемолитической активности комплемента позволяет обнаружить недостаточность компонентов комплемента, прежде всего участвующих в образовании мембраноатакующего комплекса. Кроме того, оценка этого показателя может использоваться для выявления активации комплемента, например при системной красной волчанке и гломерулонефрите, хотя чувствительность метода для этого недостаточно высока. Альтернативный путь активации комплемента исследуют редко.

Определение компонентов комплемента обычно проводят при обследовании больных с аутоиммунными заболеваниями и при подозрении на генетический дефект комплемента. Количественное определение компонентов комплемента проводят с помощью простой радиальной иммунодиффузии и нефелометрии. Так, у 15% больных с наследственным ангионевротическим отеком количественные методы исследования выявляют нормальный уровень ингибитора C1-эстеразы, в то время как его активность снижена. Функциональную активность отдельных компонентов комплемента в сывороткеисследуют следующим образом: 1) к стандартной сыворотке, лишенной какого-либо компонента комплемента, добавляют исследуемую сыворотку (источник недостающего компонента комплемента); 2) определяют гемолитическую активность комплемента. Если гемолитическая активность комплемента не восстанавливается до нормы, значит, активность этого компонента комплемента в исследуемой сыворотке снижена. Иногда дополнительно оценивают активность регуляторных компонентов комплемента, например ингибитора C1-эстеразы.